弥拜菌素高产菌株的选育

论文摘要

弥拜菌素是一种高效杀虫剂（一种米尔贝霉素A3、A4的混合物,其A3:A4的比例为30:70）,对大多数农业害虫、寄生虫具有广谱防治活性,具有良好的应用价值。本论文通过推理选育的方法迅速提高弥拜菌素产生菌的生产能力,然后对培养基和培养条件进行优化,测定发酵过程中的在线参数,为产业化生产提供可靠的工艺参数。首先通过对弥拜菌素产生菌H-101-4的复壮,获得了一株产量较高,遗传性状稳定的菌株H-103-8,产量比出发菌株H-101-4提高了4%。以H-103-8为参试菌,比较了紫外线,亚硝基胍,甲基磺酸乙酯和紫外线、亚硝基胍复合诱变的效果。结果发现:从致死率看,对菌株H-103-8的致死率甲基磺酸乙酯＞亚硝基胍＞紫外线;从诱变的正变率看,诱变效果紫外线＞亚硝基胍＞甲基磺酸乙酯;从效价的提高幅度看,经过紫外诱变后,效价比原来提高了4.8%,经亚硝基胍诱变后效价提高了7.8%,甲基磺酸乙酯诱变后效价提高了5.6%,复合诱变效果又优于单一诱变剂的诱变,效价提高了8.4%。通过对不同诱变剂诱变效果的比较,选用正变率高、产量提高幅度大的诱变剂,大大提高了筛选的效率。为减少选育过程中的工作量,我们采用了推理选育的方法。以H-103-8为出发菌株,采用亚硝基胍进行诱变处理后,进行了前体结构类似物:乙酸钠、氨基丙酮酸、丙酸钠的耐性筛选,最终获得了弥拜菌素产量达854μg/mL的菌株H-107-34,比出发菌株H-103-8提高了37%。以H-107-34为出发菌株,继续采用NTG作为诱变剂进行诱变处理,结合链霉素抗性筛选获得菌株H-108-29,最高产量达到946μg/mL,比出发菌株提高了10.7%。以纯化后的菌株H-109-2为出发菌株,经过EMS诱变处理后,结合2-去氧葡萄糖耐性筛选,获得了菌株H-110-48,产量达到994μg/mL,比出发菌株提高了4.4%。经紫外线、亚硝基胍复合诱变后,结合弥拜菌素的结构类似物米尔贝肟耐性筛选,获得了最高效价达1124μg/mL的菌株H-111-35,比出发菌株提高了13%。此外,在摇瓶水平进行了弥拜菌素发酵培养基优化的研究,探索了不同碳源、氮源、无机盐、微量元素和前体等对弥拜菌素产量的影响。结果表明:碳源以蔗糖和可溶性淀粉的混合碳源为最佳;氮源以棉籽饼粉、脱脂奶粉的混合氮源最佳;无机盐K2HPO4、MgSO4、CaCO3在低浓度时对抗生素的合成均有一定的促进作用,同时研究了微量元素和前体对产量的影响。最终在最佳碳、氮源的基础上,通过正交分析确定了一套发酵培养基的最佳配方（g/L）:可溶性淀粉20,蔗糖120,脱脂奶粉15,棉籽饼粉15,酵母粉5,FeSO40.1,K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.5,CuSO4·5H2O 0.05,ZnSO4·7H2O 0.01,Na2MoO40.05,CaCO3 3。另外,对弥拜菌素发酵条件进行了考察,即发酵温度、通气量、剪切力、种龄和移种量等。发现250 mL三角瓶中装量为25 mL,pH为7.2,接种量为6%时,在温度28℃条件下发酵12天,弥拜菌素发酵产量最高。采用新的发酵工艺后,高产菌株H-113-17的摇瓶发酵效价达到1280μg/mL,比原始菌株提高了112%。同时,研究了新的发酵工艺下弥拜菌素发酵液中生物量、pH、总糖含量、氨基氮含量、菌体浓度的代谢变化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 生物农药与米尔贝霉素
• 1.2 米尔贝霉素的分子结构
• 1.3 米尔贝霉素的理化性质
• 1.4 米尔贝霉素的生物合成
• 1.4.1 米尔贝霉素前体来源
• 1.4.2 配糖体中氧原子的来源
• 1.4.3 配糖体的合成
• 1.5 本研究的意义和内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 出发菌株
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.1.3 培养基和培养条件
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 菌种选育
• 2.2.2 菌种保藏
• 2.2.3 发酵参数的测定
• 2.2.4 HPLC测定发酵液中弥拜菌素产量
• 3 弥拜菌素高产菌株的选育
• 3.1 菌种处理
• 3.1.1 原始菌株H-101-4复壮
• 3.1.2 单孢子悬液制备
• 3.1.3 紫外线（UV）诱变
• 3.1.4 亚硝基胍（NTG）诱变
• 3.1.5 紫外线与亚硝基胍（UV+NTG）的复合诱变
• 3.1.6 甲基磺酸乙酯（EMS）诱变
• 3.2 弥拜菌素高产菌株的理性化筛选
• 3.2.1 自然选育（NS）
• r）'>3.2.2 乙酸钠耐性突变株筛选（NaAc^r）
• r）'>3.2.3 氨基丙酮酸耐性突变株筛选（AA^r）
• r）'>3.2.4 丙酸钠耐性突变株筛选（PRP^r）
• r）'>3.2.5 链霉素抗性突变株筛选（STR^r）
• r）'>3.2.6 2-去氧-D-葡萄糖耐性突变株筛选（DOG^r）
• r）'>3.2.7 米尔贝肟抗性突变株筛选（MIL^r）
• 3.2.8 筛选流程
• 3.3 菌株遗传稳定性考察
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 原始菌株H-101-4复壮
• 3.4.2 诱变剂的选择
• 3.4.3 理性筛选效果
• 3.4.4 弥拜菌素选育系谱图
• 3.4.5 菌株稳定性
• 3.4.6 出发菌株与诱变后高产菌株发酵产物的HPLC图谱
• 4 对弥拜菌素高产菌株H-113-17发酵特性的研究
• 4.1 原始培养基
• 4.2 弥拜菌素发酵过程中的基本操作
• 4.3 发酵培养基的优化
• 4.3.1 单因素试验
• 4.3.2 利用正交试验选择培养基的最适配比
• 4.4 发酵条件试验
• 4.4.1 发酵温度实验
• 4.4.2 通气量实验
• 4.4.3 剪切力的敏感性实验
• 4.4.4 无机盐的敏感性实验
• 4.4.5 微量元素对弥拜菌素产量的影响
• 4.4.6 前体物质对弥拜菌素产量的影响。
• 4.4.7 泡敌对弥拜菌素产量的影响
• 4.4.8 种龄和移种量的交叉实验
• 4.5 弥拜菌素发酵代谢过程中在线参数的检测
• 4.5.1 产素变化实验
• 4.5.2 发酵液生物量测定
• 4.5.3 发酵液pH的测定
• 4.5.4 还原糖的测定
• 4.5.5 氨基氮的测定
• 4.6 实验结果与分析
• 4.6.1 发酵温度
• 4.6.2 通气量
• 4.6.3 剪切力
• 4.6.4 无机盐对弥拜菌素产量的影响
• 4.6.5 微量元素对弥拜菌素产量的影响
• 4.6.6 添加前体物质对弥拜菌素产量的影响
• 4.6.7 泡敌对弥拜菌素产量的影响
• 4.6.8 发酵培养基的优化
• 4.6.9 种龄和接种量的影响
• 4.6.10 代谢过程中在线参数检测
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文