论文摘要
恶性黑素瘤（Malignant melanoma,MM）,作为来源于黑素细胞（Melanocyte,MC）的恶性肿瘤,是目前侵袭性最强、致死率最高的皮肤恶性疾病。转移性MM更是对所有的治疗策略都存在耐受,预后极差,5年生存率低,对人类造成了极大的危害。但是,MM如何进展为一种高度攻击性疾病的相关机制却仍被人们知之甚少。乙酰肝素酶（Heparanase,HPSE-1）,一种哺乳动物的β-葡萄糖醛酸内切酶,在多种恶性肿瘤的侵袭、转移、预后和低生存率中扮演着重要的角色。HPSE-1由于具有酶解基底膜（Basement membrane,BM）和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的主要成分——硫酸乙酰肝素多糖链（Heparan sulfate proteoglycans,HSPGs）的活性,参与ECM的降解和重塑,因此HPSE-1表达的升高与肿瘤进展的关系非常密切,反之,下调HPSE-1的表达已成为恶性肿瘤的有效治疗策略。虽然,HPSE-1在肿瘤中的研究已取得很大的进展,但HPSE-1促进肿瘤发展的机制尚有很多问题亟待探讨。许多证据表明,HPSE-1与诸多生长因子的关系密切,很可能与肿瘤进展相关。HPSE-1主要通过其胞外的酶解活性和参与胞内信号转导,调节生长因子的表达和活性。而在生长因子中,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）,作为一个与血管形成密切相关的关键因子,是肿瘤进展和转移所必需的。因此,我们做出如下推测:HPSE-1一方面可降解HSPGs从而释放在ECM寄居的VEGF,另一方面,HPSE-1可通过参与细胞信号转导来诱导VEGF的表达;继而VEGF的释放和表达增高可促使与受体的结合,从而启动相关信号途径,这些途径的激活可上调与细胞增生、存活、侵袭和转移相关的核内转录因子,而在这些因子中,其中有部分可通过结合HPSE-1的启动子而调节HPSE-1的转录和表达。据此,VEGF在肿瘤中极可能具有尚未被发现的调节HPSE-1表达的功能。根据以上的论述,我们假设HPSE-1和VEGF在MM中存在双向相互上调关系,而此关系作为一种新型机制很可能在MM的进展中起着决定性的作用。本研究的目的在于证实HPSE-1和VEGF的相互上调关系存在于MM,并阐明此种关系对MM细胞的恶性生物学行为所产生的效应和影响,为进一步揭示MM的发病机制、拓宽MM的治疗策略提供新的思路和理念。实验一HPSE-1和VEGF在MM细胞存在双向上调关系方法和结果:①载体构建和鉴定:经酶切和测序鉴定,成功构建了HPSE-1的SiRNA表达载体;②细胞的转染和目的基因表达的鉴定:成功筛选出稳定转染HPSE-1表达载体和VEGF表达载体的A2058细胞系,并经鉴定,各转染目的基因的表达在mRNA和蛋白水平均有显著的升高,而瞬时转染二者SiRNA载体的细胞,也显示了对目的基因的明显抑制效应;③HPSE-1对VEGF表达的调控:当上调HPSE-1的表达时,VEGF的荧光定量PCR、Western-blot及ELISA结果均显示,VEGF的表达水平随之升高;而抑制HPSE-1的表达时,VEGF的表达水平随之降低,说明HPSE-1可调节VEGF的表达;④VEGF对HPSE-1表达的调控:当通过表达载体、SiRNA的转染以及外源性VEGF的加入来调控VEGF后,HPSE-1的表达水平无论在mRNA还是蛋白水平均出现相应的变化,提示VEGF反过来也可调节HPSE-1的表达;⑤PD98059对二者相互上调关系的影响:应用MEK/ERK的特异性抑制剂——PD98059分别作用于表达HPSE-1和VEGF的稳定转染细胞系,HPSE-1和VEGF的相互上调均出现不完全的阻滞,同时MEK/ERK信号通路的激活状态也得到抑制。结论:首次体外发现MM细胞中HPSE-1和VEGF存在双向上调关系,而这种双向上调可被MEK/ERK信号通路的抑制剂PD98059不完全的阻滞。实验二HPSE-1与VEGF的双向上调关系对MM细胞的恶性生物学行为的影响方法和结果:①细胞增殖活性检测:MTT实验结果发现HPSE-1和VEGF的转染可提高A2058细胞的增殖能力,而PD98059对此有抑制效应;②细胞侵袭力检测:Transwell侵袭实验的结果与MTT的结果基本一致,HPSE-1和VEGF的转染细胞组透过微孔膜细胞数明显高于对照组,但可被PD98059阻滞;③裸鼠成瘤实验:将各组肿瘤组织称重,结果显示HPSE-1和VEGF的转染细胞组,分别给予VEGF的中和单抗——Avastin干预后,其肿瘤重量均明显减小;④瘤组织形态学观察:转染HPSE-1细胞组的瘤组织行HE染色,发现未加入Avastin组细胞生长状态较好,瘤体中间有微血管形成,而加入Avastin组,肿瘤细胞坏死明显,瘤体内可见片状坏死区,说明HPSE-1所诱导产生的VEGF被Avastin中和,肿瘤血管生成障碍;⑤瘤组织HPSE-1的mRNA水平检测:转染VEGF的A2058细胞接种裸鼠体内,在给予Avastin后,中和VEGF的同时,降低了HPSE-1的mRNA水平,说明在体VEGF对HPSE-1的表达仍然具有调控作用。结论:体内和体外研究均发现HPSE-1和VEGF的双向上调可促进MM细胞增殖、侵袭和生长速度;体外应用PD98059或体内应用Avastin,即打断二者的相互联系,可降低和抑制HPSE-1和VEGF的相互上调所赋予MM细胞的高度增殖、侵袭和生长能力。综上所述,我们首次提出并证实:HPSE-1和VEGF在MM中存在相互诱导调控的关系,而这种关系仿佛是促进MM细胞不断增殖、抗凋亡、转移增强和血管形成的动力之所在;反之,打断二者的相互上调关系,可逆转和抑制这种相互关系所赋予MM细胞的各种恶性特征。因此,该研究的完成为揭示MM的发病机制、探寻MM的治疗策略提供了新的靶点,开拓了新的思路。
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标签：乙酰肝素酶论文; 血管内皮生长因子论文; 恶性黑素瘤论文; 信号途径论文; 转录因子论文;