超抗原SEB抗肿瘤效应研究

论文摘要

作为强大的T细胞激活剂，SEB在抗肿瘤方面有着潜在的应用价值，可以通过超抗原依赖的细胞毒作用（SDCC）直接对MHC Ⅱ类阳性的肿瘤细胞进行杀伤，但是，葡萄球菌肠毒素B可以导致呕吐腹泻并引起食物中毒等，这些副作用严重限制了其临床应用。SEB（H12D／H32D）、SEB（H105D／H121D）、SEB（H12D／H32D／H105D／H121D）、SEB（H32D）、SEB（H32Q）、SEB（H32L）是我们实验室构建的一组葡萄球菌B型肠毒素突变体，本研究中我们系统地评价了该系列突变体作为抗肿瘤制剂的可能性。首先通过幼猫催吐实验评价了该系列突变体的致吐活性，发现在高达5-10倍致吐剂量的攻击下，SEB（H105D／H121D）与SEB（H32Q）组5只猫中有4只没有出现呕吐反应，而对照组wt-SEB组全部出现呕吐反应，这两个突变体不仅与wt-SEB具有类似的MHC Ⅱ类分子结合活性，而且在针对SMMC-7721与KB两种不同来源的肿瘤细胞的体外抑瘤活性实验中均具有良好的肿瘤细胞生长抑制能力，SEB（H32Q）对SMMC7721的半数抑制浓度仅为0.798ng／mL，在建立的C57BL／6 Lewis肺癌模型中，腹腔给予125μg／kg的SEB（H32Q）可明显抑制小鼠的肿瘤生长，与生理盐水对照组相比具有显著性差异（P＜0.05），且治疗组与对照组相比，出现了明显的肿瘤坏死和淋巴细胞浸润。我们第一次证实了SEB（H32Q）作为肿瘤免疫治疗制剂的可行性，体内外实验均证明该突变体分子具有较高的肿瘤抑制活性。 SDCC具有MHC-Ⅱ限制性，只能裂解表达MHC-Ⅱ类抗原的靶细胞。但许多肿瘤细胞MHC-Ⅱ类分子表达水平低下或缺失，使超抗原对肿瘤细胞的杀伤不能借助SDCC作用，治疗效果令人失望。抗肿瘤特异性抗体与超抗原偶联形成的靶向超抗原可以通过超抗原抗体依赖的细胞毒作用（SADCC作用）克服这一缺点，从而有效的裂解肿瘤细胞。因此我们制备了以连接肽GGGSGGS连接抗肝癌基因工程抗体scFv25和SEB的融合蛋白（scFv-SEB）并对其体外抗肿瘤活性进行了系统评价。首先我们采用生物信息学软件对融合蛋白scFv-SEB分子的可及性与柔性，抗原性与疏水性以及二级结构等进行了预测与分析，结果显示，融合后对scFv及SEB具有各自的空间结构，连接肽具有低抗原性和高结合活性，

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 葡萄球菌肠毒素B（SEB）及组氨酸替代突变体的抗肿瘤作用研究
• 实验研究一 组氨酸替代突变体的表达纯化
• 1.材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验方法
• 2.实验结果
• 2.1 重组突变体的诱导表达
• 2.2 离子交换色谱纯化
• 2.3 各突变体蛋白的Western-Blotting鉴定
• 3.讨论
• 实验研究二 组氨酸替代突变体的减毒作用分析与抗肿瘤作用研究
• 1.材料与方法
• 1.1 实验动物和细胞株
• 1.2 主要试剂、仪器
• 1.3 主要实验方法
• 2.实验结果
• 2.1 体外肿瘤杀伤实验
• 2.2 乳猫催吐实验
• 2.3 MHCⅡ类分子结合实验
• 2.4 体内抑瘤实验
• 3.小结
• 4.讨论
• 第二部分 抗肝癌单链抗体（scFv）靶向超抗原SEB的构建与活性评价
• 实验研究一 融合蛋白的初步生物信息学设计与分析
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 2.1 可及性（Accessibility）和柔性（Flexibility）分析
• 2.2 抗原性（Antigenicity）和疏水性（Hydrophobicity）分析
• 2.3 二级结构预测与分析
• 3.实验结果
• 3.1 可及性和柔性分析结果
• 3.2 抗原性和疏水性分析结果
• 3.3 二级结构预测结果
• 4.讨论
• 实验研究二 系列抗体靶向超抗原的构建、表达与筛选
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 试剂和溶液
• 1.3 主要仪器
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 单链抗体靶向超抗原的基因扩增
• 1.6 抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子克隆载体的构建和鉴定
• 1.7 抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子表达载体的构建和鉴定
• 1.8 不溶性蛋白的变复性
• 1.9 系列抗肝癌单链抗体靶向超抗原融合分子的筛选
• 2.实验结果
• 2.1 靶向超抗原融合分子的构建与鉴定
• 2.2 融合分子的诱导表达与表达形式鉴定
• 2.3 包涵体蛋白的变性复性
• 2.4 融合蛋白分子的筛选
• 3.小结
• 实验研究三 单链抗体靶向超抗原SEB的构建、表达与纯化
• 1.材料与方法
• 1.1 引物
• 1.2.scFv-SEB-6xHis tag-pTIG-Trx的构建与鉴定
• 1.3.Western blot鉴定
• 1.4.scFv-SEB-His tag的金属螯合层析纯化与脱盐
• 2.结果
• 2.1 scFv-SEB-6xHis tag-pTIG-Trx的构建与鉴定
• 2.2 重组表达质粒在大肠杆菌中的诱导表达和表达形式分析
• 2.3 重组蛋白的Western blot鉴定
• 2.4 重组蛋白的纯化与脱盐
• 3.小结
• 4.讨论
• 实验研究四 单链抗体靶向超抗原scFv-SEB的抗肝癌效应评价
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞和试剂
• 1.2 细胞的包被
• 1.3 淋巴细胞分离方法
• 1.4 细胞ELISA测定重组蛋白的稳定性和抗体的体外结合活性
• 1.5 细胞免疫组化法检测单链抗体靶向超抗原SEB与肝癌细胞系SMMC-7721的 结合能力。
• 1.6 MTS比色法测定重组蛋白的细胞杀伤活性检测
• 1.7 乳酸脱氢酶（LDH）法测定重组蛋白的SACCC作用
• 2.结果
• 2.1 细胞ELISA测定的体外结合活性
• 2.2 免疫细胞化学检测scFv-SEB对SMMC-7721的结合活性
• 2.3 细胞ELISA测定scFv-SEB的稳定性
• 2.4 scFv-SEB对SMMC-7721的细胞杀伤活性检测
• 2.5 LDH法结合HLA-DR抗体封闭实验检测SADCC作用
• 3.小结
• 4.讨论
• 第三部分 二硫键稳定抗体靶向超抗原SEB（dsFv-SEB）的构建与鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株、质粒、试剂与溶液
• 1.2 引物设计与合成
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 PCR产物的回收与纯化,T载体连接与鉴定,序列测序确证,表达载体的构建与鉴定等
• 1.5 工程菌的诱导表达与表达形式鉴定
• 1.6 包涵体的洗涤及变复性
• 1.7 复性产物的纯化
• 1.8 细胞ELISA
• 2.实验结果
• 2.1 抗肝癌单链二硫键稳定抗体的扩增
• 2.2 表达载体的酶切鉴定
• 2.3 蛋白的诱导表达
• 2.4 包涵体的洗涤
• 2.5 包涵体的纯化与二硫键形成鉴定
• 2.6 不同VH、VL组合以及变复性条件对形成dsFv的影响
• 2.7 复性后dsFv-SEB的结合活性与稳定性检测
• 3.小结
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 在学期间主要发表或待发表的文章:
• 专利申请情况:
• 在学期间参加完成的主要工作:
• 综述