黑曲霉内切β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆，优化及在毕赤酵母中的表达研究

论文摘要

内切β-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.4）是一种重要的工业用酶,广泛应用于饲料工业,酿造业等领域。随着生产的发展,β-1,4-葡聚糖酶需求量日益增加。本实验的主要目的就是,从分泌热稳定性的β-1,4-葡聚糖酶的黑曲霉高产菌株中,克隆该基因,利用基因工程手段实现高效表达,满足工业生产的需求。实验首先是利用RT-PCR技术,提取黑曲霉（Aspergillus niger）L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因egⅠ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1-1#和1-5#,在摇瓶发酵水平上,以0.5%的β-葡聚糖为底物检测,酶活分别达到1 456 U/mL和1 928 U/mL。重组酶最适pH为5.0,最适反应温度为70℃,在70℃时保温30 min后仍然具有90%以上的活力。为了进一步提高表达量,根据毕赤酵母偏爱的密码子优化来源于A.niger L3的内切β-1,4-葡聚糖酶的DNA序列,共改变193个碱基,G+C%由54%下降到44.22%。设计了14对寡聚核苷酸引物,采用重叠延伸PCR三步法获得全长基因序列共改变。将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9k-syn-egⅠ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板以及摇瓶筛选,得到重组毕赤酵母工程菌2-7#。摇瓶发酵条件下,以0.5%的葡聚糖和1%的CMC-Na为底物检测,酶活分别达到3 658 U/mL和591.9 U/mL;采用50 L发酵罐进行发酵,酶活则分别达到65 649.6 U/mL和39 728.32 U/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 β-葡聚糖概述
• 1.2 纤维素概述
• 1.3 β-1,4-葡聚糖酶
• 1.3.1 性质与分布
• 1.3.2 结构特征
• 1.3.3 基因工程研究
• 1.4 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统
• 1.4.1 表达载体
• 1.4.2 宿主菌株
• 1.4.3 优化表达的策略
• 1.4.4 发酵条件优化
• 1.5 研究目的:
• 第二章 黑曲霉来源的内切β-1,4-葡聚糖酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 工具酶
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 培养基和部分溶液的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 黑曲霉中菌丝RNA的提取
• 2.2.2 反转录
• 2.2.3 葡聚糖酶基因的克隆
• 2.2.4 序列测定
• 2.2.5 酵母重组表达载体的构建
• 2.2.7 重组酵母的构建
• 2.2.9 重组酵母的产酶发酵
• 2.2.10 酶活检测
• 2.2.11 SDS-PAGE电泳
• 2.2.12 重组酶的酶学性质
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 葡聚糖酶基因的克隆
• 2.3.2 葡聚糖酶基因序列的测定
• 2.3.3 表达质粒的构建及验证
• 2.3.4 重组酵母的筛选
• 2.3.5 重组酵母工程菌的产酶发酵
• 2.3.6 重组酶的酶学性质
• 2.4 讨论
• 第三章 内切β-1,4-葡聚糖酶基因优化及其在毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 工具酶
• 3.1.3 试剂
• 3.1.4 培养基和部分溶液的配制
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因（egⅠ）密码子优化
• 3.2.2 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因的合成
• 3.2.3 重组表达载体的构建
• 3.2.4 重组表达载体pPIC9K-syn-eg Ⅰ的抽提和验证
• 3.2.5 重组酵母的构建
• 3.2.6 重组酵母的筛选
• 3.2.7 发酵条件的优化
• 3.2.8 发酵条件的优化
• 3.2.9 重组酵母发酵罐水平高密度发酵
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的合成
• 3.3.2 密码子优化的内切β-1,4-葡聚糖酶基因syn-eg Ⅰ的序列测定
• 3.3.3 重组表达载体的验证
• 3.3.4 重组酵母的筛选
• 3.3.5 发酵条件的优化
• 3.3.6 发酵罐水平的高密度发酵
• 3.4 讨论
• 3.4.1 密码子优化
• 3.4.2 基因合成技术
• 3.4.3 发酵条件的优化
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 Vector NTI Suite软件比对测序结果
• 附录2 硕士期间发表的论文情况