红曲霉丙酮酸脱羧酶基因克隆表达及酶学性质分析

论文摘要

目的丙酮酸脱羧酶（Pyruvate decarboxylase, PDC, E.C.4.1.1.1）是丙酮酸代谢的关键酶,它也能催化芳香族氨基酸前体生物转化成光活性α-羟基酮。本研究构建红曲霉cDNA文库,筛选得到丙酮酸脱羧酶PDC基因,原核表达pdc基因,分析并比较红曲霉重组丙酮酸脱羧酶与野生型丙酮酸脱羧酶的活性与动力学性质的差别。方法使用Trizol提取红曲霉的总RNA,利用Creator SMART cDNA文库构建试剂盒构建红曲霉cDNA文库,筛选丙酮酸脱羧酶基因,利用聚合酶链反应（PCR）技术从克隆载体DNA中扩增出pdc基因。对扩增片段和表达质粒进行酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,挑取若干单克隆菌落进行PCR鉴定,阳性克隆产物送去测序。将重组质粒pET-PDC转化大肠杆菌BL21（DE3）,涂布于氨苄青霉素抗性平板,37℃培养过夜,挑取若干单克隆菌落进行PCR鉴定。IPTG诱导表达阳性转化菌,SDS-PAGE检测目的蛋白,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行稀释复性。将红曲霉在马铃薯培养基中30℃培养7天,收集菌体,超声波破碎细胞,离心,取上清。硫酸铵（NH4）2SO4盐析获得粗酶液,分别经凝胶层析柱SephadexG-25与DEAE阴离子交换柱纯化蛋白。SDS-PAGE检测纯度。分别测重组PDC和野生型PDC的活性,并分别分析二者的动力学性质,比较两者的异同点。结果成功构建红曲酶cDNA文库,筛选得到了红曲霉丙酮酸脱羧酶pdc基因,pdc基因的开放阅读框长1713 bp,编码一个570个氨基酸残基的蛋白质,其序列已向GenBank提交并被收录,序列号为HM 191265。重组PDC在原核细胞E.coli BL21（DE3）中高效表达,约占菌体总蛋白的32.7 %,经亲和层析纯化,重组蛋白的纯度达95 %左右。偶联酶法测定该酶的活性,二者的最适反应条件均为pH 6.0,30℃,在最适条件下测得重组PDC与野生型PDC比活分别为20.2 U/mg、30.1 U/mg;重组PDC的Km值为2.6 mmol/L,野生型PDC Km值为0.56 mmol/L。结论红曲霉pdc基因可在大肠杆菌中高效表达,红曲霉PDC活力较高、稳定性较好,可用作生物燃料乙醇生产的候选资源。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 序言
• 1 PDC 的结构与性质
• 1.1 PDC 的基本结构特性
• 1.2 PDC 的酶学性质
• 1.3 PDC 的空间结构
• 2 pdc 基因
• 3 PDC 的应用
• 第一部分 红曲霉cDNA 文库的构建
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 红曲霉的培养
• 2.2.2 总RNA 提取
• 2.2.3 第一链cDNA 的合成
• 2.2.4 LD PCR 扩增双链cDNA
• 2.2.5 蛋白酶K 消化
• 2.2.6 SfiⅠ酶切
• 2.2.7 cDNA 的分级分离纯化
• 2.2.8 双链cDNA 与克隆载体pDNR-LIB 连接
• 2.2.9 感受态大肠杆菌DH5α的制备
• 2.2.10 转化（电转）
• 2.2.11 文库的扩增
• 2.2.12 原始文库质量鉴定
• 3 结果与讨论
• 3.1 总RNA 提取
• 3.2 双链cDNA 的合成及分级
• 3.3 文库质量的检测及扩增
• 4 结论
• 第二部分 红曲霉丙酮酸脱羧酶基因的克隆
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 丙酮酸脱羧酶基因的筛选
• 2.2.2 PDC 基因的克隆
• 3 结果与讨论
• 3.1 红曲霉pdc 基因的筛选与测序分析
• 3.2 pdc 基因的PCR 扩增结果
• 3.3 原核表达载体pET-PDC 构建
• 3.4 重组质粒测序结果与分析
• 4 结论
• 第三部分 红曲霉丙酮酸脱羧酶的表达、纯化及复性
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 重组质粒pET-PDC 转化大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.2.2 诱导表达
• 2.2.3 蛋白抽提
• 2.2.4 在变性条件下纯化含有6×his 标签的融合蛋白
• 2.2.5 蛋白浓度的测定
• 2.2.6 重组PDC 的复性
• 3 结果与讨论
• 3.1 转化子的菌落PCR 鉴定
• 3.2 重组PDC 的SDS-PAGE 检测
• 3.3 蛋白抽提
• 3.4 蛋白纯化
• 3.5 蛋白浓度的测定
• 4 结论
• 第四部分 红曲霉丙酮酸脱羧酶的酶学性质分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要试剂和培养基的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 酶活测定方法
• 2.2.2 野生型红曲霉PDC 的提取分离
• 2.2.3 酶学性质分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 酶的活性
• 3.2 红曲霉PDC 酶学性质分析
• 3.2.1 Km 值
• 3.2.2 温度
• 3.2.3 pH
• 4 结论
• 总结与展望
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 硕士期间发表的论文
• 致谢