论文题目: 粉纹夜蛾细胞对Bt Cry1Ac毒素的抗性特点及其机制的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 农药学
作者: 刘凯于
导师: 洪华珠
关键词: 昆虫离体细胞,抗性筛选,抗性发展,抗性机制
文献来源: 华中师范大学
发表年度: 2005
论文摘要: 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)合成的杀虫晶体蛋白或转Bt基因植物表达的毒素蛋白对多种害虫具有特异性毒杀作用,是环境友好的生物农药,被广泛地用于防治农业和卫生害虫。但是害虫也能对Bt或其产物杀虫晶体蛋白产生高水平的抗性,这严重威胁着Bt资源的可持续利用。只有深入了解昆虫对Bt的抗性特点及其机制,才能制定出合理的抗性治理策略,从而延缓害虫抗性的产生。但到目前为止,由于虫体生理和生化十分复杂,抗性昆虫筛选费时费力,人们对昆虫抗性的研究进展缓慢,Bt抗性的研究仍是当前的热点之一。本文没有采用筛选抗性昆虫的方法,而是另外选择筛选抗性昆虫培养细胞作为研究材料,以揭示昆虫的Bt抗性特点及其机制。该文以MTT法检测了粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)胚胎细胞系BTI-TN-5B1-4(简称TnH5或Hi5)对Cry1Ac的抗性发展及其规律:以ELISA、配体印迹和荧光标记法比较了敏感和抗性两种细胞与Cry1Ac毒素的结合;克隆了两个类氨肽酶N基因的cDNA片断并测定了敏感和抗性两种细胞的氨肽酶和碱性磷酸酶的相对活力;以mRNA差异显示法和蛋白质组学技术研究了敏感和抗性两种细胞差异表达的mRNA和特异的蛋白质,并据此探讨了抗性产生的机制。本论文的主要结果如下: 1.以Cry1Ac活性毒素逐代筛选抗性粉纹夜蛾离体细胞TnH5,抗性发展速度呈S形曲线,经56代选择后,抗性比上升至1,280倍。在除去选择压力后,抗性比逐渐下降;低水平抗性细胞抗性衰退较快,而高抗性细胞抗性衰退较缓慢。抗性比衰退至1.5倍的细胞在重新筛选后抗性比恢复较快。抗性细胞对BtGC-91、B. thuringiensis sub. azawai和B. thuringiensis sub. kurstaki的复合晶体活性毒素都具有较高的交互抗性(大于100倍),对Cry1C的交互抗性为19.7倍,对测试的两种化学农药灭多威和水胺硫磷无交互抗性。 2.采用ELISA、配体Western-blot和荧光素标记法比较了敏感和抗性两种细胞结合的毒素数量。ELISA法检测表明抗性细胞总蛋白和膜蛋白结合的毒素数量都少于敏感细胞。配体Western印迹实验显示:抗性细胞和敏感细胞的膜蛋白与总蛋白都有5条电泳迁移率相同的毒素结合蛋白带,其分子量分别约为207kD、159kD、119kD、72kD、39kD;抗性细胞和敏感细胞的总蛋白都比其膜蛋白多出了33kD和32kD两条阳性带;抗性细胞的119kD的阳性带比敏感细胞的弱。将活化的Cry1Ac以FITC标记,再分别与固定过的敏感和抗性两种细胞结合,然后在荧光显微镜下观察,结果表明敏感细胞胞荧光比抗性细胞的稍强。总之,3种方法检测到敏感和抗性两种细胞都能与Cry1Ac毒素结合,但结合的毒素量存在差异。澎博士学位论文DOCTORALDISSER异汀ION 3.为初步探讨苏云金芽抱杆菌杀虫晶体蛋白与昆虫细胞的相互作用机制,研究了一些化学物质对cry1Ac毒素与昆虫离体细胞T妞HS相互作用的影响。结果表明:N一糖基化抑制剂衣霉素、蛋白质合成抑制剂放线菌酮、胞吞作用抑制剂莫能菌素和胰蛋白酶预处理,都能不同程度地提高Tnl巧细胞对cry1Ac毒素的敏感性,其中胰蛋白酶预处理的作用最明显,而N一乙酞半乳糖胺和半乳糖都不能抑制Cry1Ac毒素对这种离体细胞的毒力。这表明抑制细胞蛋白质的糖基化能提高细胞对C巧IAc毒素的敏感性,使用胰蛋白酶温和降解细胞表面的蛋白质也能提高肠由5细胞对毒素的敏感性。推测细胞表面某些糖蛋白的上调表达可能与抗性的形成有关。此外,抗性细胞对低渗透压的耐受性也显著增强。 4.为了比较敏感与抗性两种细胞中C卿IAc的受体氨肤酶N,根据鳞翅目昆虫氨肤酶N的保守序列,设计了多对简并引物,采用Rl:PCR等技术分别对两种细胞的氨肤酶N基因cDNA片段进行了克隆,序列分析和拼接,并测定了敏抗细胞中的氨肤酶和碱性磷酸酶的相对活性。通过两对引物扩增出了两种APN基因的cDNA片段,大小分别为188和564bp,分别命名为T几APN188(GenBank.Aceession:CD809324)和T留JN564(GenBank习气ceession:CD809326),对这两个片段推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果表明两者与已报道的鳞翅目昆虫中肠的C守IAc毒素受体氨肤酶N有较高的同源性。抗性细胞中氨肤酶的相对活力为敏感细胞的0.84倍。敏抗两种细胞的碱性磷酸酶相对活性没有区别。这表明T妞HS细胞可能具有昆虫中肠刷状缘上的cry1A。毒素受体氨肤酶N和碱性磷酸酶。 5.为了从转录组水平探讨抗性产生的分子机制,采用DDRI’- PCR技术比较了抗性细胞R80的mRNA与敏感细胞的差异,经逆向RNA斑点印迹杂交检测到5个片段为两种细胞的显著差异表达序列标签(ESTs)。序列分析结果表明,敏感细胞特有的三种ESTs都位于cDNA的非编码区,两种ES几(GenBank注册号:51,C邢22415;53,C邢22417)与数据库中ESTs没有显著同源性,另一种52(GenBank注册号:CF322416)与已登录的某些昆虫的ESTs具有一定的同源性。从抗性细胞特有的Rl(GenBank注册号:CF322413)推导出的氨基酸序列与磷酸烯醇式丙酮酸竣激酶有60一63%的同源性,从抗性细胞特有的RZ(GenBank注册号:c刃22414)推导出的氨基酸序列与类粘蛋白有约30%的同源性。这些ESTs所代表的基因可作为抗性相关的候选因子。 6,为了从蛋白质组水平探讨抗性产生的分子机制,采用双向电泳技术分离了敏感和?
发布时间: 2005-07-22
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