Lin28与胃癌细胞化疗耐药关系的研究

论文摘要

背景：胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤,致死率居各类肿瘤的第二位,我国是胃癌的高发区,胃癌年患病率和死亡率均为世界平均水平的2倍多。手术仍然是可能治愈胃癌的唯一手段,但大约2/3患者的病情在确诊时已属于进展期胃癌,术后复发及转移率很高,即使对这部分病人进行有效的化疗放疗等综合治疗,五年生存率仅仅约40%左右。因此进一步深入研究胃癌的生物学行为,发现与胃癌的进展、转移、复发以及治疗耐受相关的基因,对进一步提高胃癌治疗效果具有十分重大的意义。Lin28是一个小RNA结合蛋白,在胚胎干细胞中含量丰富,而在成熟细胞中含量极低或缺失。研究发现作为干细胞指标的Lin28与诱导多能干细胞的形成、miRNA（如Let-7, miR-107）的加工成熟和肿瘤干细胞特性的维持等均具有重要的相关性。肿瘤干细胞不仅仅是肿瘤的起源,而且与肿瘤的进展、转移、治疗耐受以及肿瘤复发等均相关。Lin28作为干细胞的指标之一,在肺癌细胞研究显示,Lin28可诱导肺癌细胞放疗耐受。Lin28在胃癌中是否有表达,表达水平如何,其表达水平的高低能否诱导肿瘤进展及治疗耐受；在胃癌细胞中抑制该蛋白的表达是否有重要的作用,能否逆转肿瘤进展及治疗耐受,目前还不明确,值得进一步研究。方法和结果：1.稳定表达Lin28胃癌细胞的构建以及Lin28与胃癌细胞化疗耐药相关性的体外研究在胃癌细胞（MKN28、MKN45、SGC7901、SGC823）中,我们采用RT-PCR及western blot技术检测Lin28 RNA水平及蛋白水平的表达量。Lin28 RNA水平在四株胃癌细胞中均有表达,但是在蛋白水平上没有表达。挑选Lin28蛋白表达阴性胃癌细胞SGC7901,稳定转染质粒pcDNA3.1+-Lin28以及对照空质粒pcDNA3.1+,用western bolt技术检测Lin28表达水平,转染后两株细胞分别标记为SGC7901/Lin28和SGC7901/mock.用MTT技术比较转染后两株稳定转染细胞株生长情况,结果显示SGC7901/Lin28和SGC7901/mock细胞生长情况未见明显差异（P>0.05）。用流式细胞PI单染技术比较两株稳定转染细胞株细胞周期情况未见明显差异（P>0.05）。我们用MTT技术,PI单染流式细胞技术以及Giemsa染色凋亡细胞计数法检测SGC7901/Lin28和SGC7901/mock在化疗药物作用下的凋亡率的差异。MTT细胞存活率分析结果提示在化疗药物（顺铂、紫杉醇）的作用下SGC7901/Lin28细胞的存活率高于对照组SGC7901/mock。流式细胞PI单染技术检测显示在化疗药物（顺铂、紫杉醇）的作用下SGC7901/Lin28细胞的凋亡率低于对照组SGC7901/mock （P<0.05）。Giemsa染色凋亡细胞计数法检测结果显示在化疗药物（紫杉醇）的作用下SGC7901/Lin28细胞的凋亡率低于对照组SGC7901/mock（P<0.05）.可见Lin28可以在胃癌细胞中诱导化疗耐药。用siRNA干扰技术,敲低SGC7901/Lin28细胞中Lin28表达量,可以逆转Lin28诱导的耐药情况。为初步研究Lin28诱导耐药的机制,用qRT-PCR的方法检测两组胃癌细胞SGC7901/Lin28细胞和SGC7901/mock细胞中miRNA （Let-7a、Let-7b、Let-7c、miR-107）表达情况。结果提示：SGC7901/Lin28中Let-7a、Let-7b、Let-7c、miR-107表达量比SGC7901/mock明显下降,用siRNA感染技术干扰SGC7901/Lin28中Lin28表达可以上调上述miRNA的表达。上述结果提示Lin28可以抑制部分miRNA表达,这可能是Lin28诱导化疗耐药的机制之一2.Lin28表达与胃癌新辅助化疗后病理反应的相关性分析2004年至2010年我院肿瘤外科胃癌患者接受新辅助化疗患者共107例,选取其中本院完整保存有化疗前胃镜标本及术后手术标本的新辅助化疗胃癌患者21例。把21例新辅助化疗胃癌患者分为两组,化疗疗效临床评估有效组（CR+PR）和化疗疗效临床评估无效组（SD+PD）,临床有效率为52.3%（11例）均为部分缓解（PR）,42.9%（9例）病情稳定（SD）,4.8%（1例）病情进展（PD）。在临床有效的11例胃癌患者中有1例患者术后病理提示完全缓解（PCR）。把21例新辅助化疗胃癌患者分为两组,化疗疗效病理评估有效组（0～50%肿瘤细胞残留）和化疗疗效临床评估无效组（>50%肿瘤细胞残留）病理有效率（0～50%肿瘤细胞残留）为66.7%（14例）,其中pCR4.8%（1例）,33.3%（7例）患者化疗无效（>50%肿瘤细胞残留）。卡方检验分析结果显示Lin28表达水平和新辅助化疗后病理反应（0-50肿瘤细胞残留vs.>50肿瘤细胞残留）相关（P=0.024）, Lin28阳性病例的病理反应率低,肿瘤细胞残留多。化疗前后两组Lin28表达情况进行配对分析,发现化疗前Lin28表达较化疗后低（P=0.008）。结果提示,在胃癌患者中,Lin28高表达的胃癌对化疗耐药,Lin28是预测胃癌化疗疗效的指标。3.Lin28在胃癌及癌旁正常组织中表达水平及在胃癌组织中Lin28表达水平与所有胃癌患者以及术后辅助化疗胃癌患者的预后相关性分析选取了215例资料完整的胃癌病例进行Lin28表达水平的回顾性研究。采用用免疫组化技术检测215例胃癌组织及其配对正常胃组织Lin28蛋白表达水平。结果显示Lin28在胃癌组织及正常组织中均有表达,胃癌组织中Lin28表达率为46.0%,正常组织中表达率为74.4%。用配对T检验,胃癌组织Lin28表达率低于配对正常组织（P=0.038）根据Lin28表达情况分成两组（Lin28阳性组和Lin28阴性组）,两组患者一般情况可比。两组患者肿瘤浸润深度和淋巴转移情况没有明显差异,Lin28阳性组患者远处转移/复发率高于Lin28阴性组（P=0.028）。生存分析显示,五年无病生存率Lin28阳性组为50.8%；Lin28阴性组为69.4%（P=0.024）。五年总生存率Lin28阳性组为55.5%；Lin28阴性组为71.1%（P=0.022）。多元回归结果显示Lin28与肿瘤浸润浆膜及淋巴转移均是影响胃癌预后的独立因子。进一步进行分层分析,寻找Lin28与化疗的关系对患者预后的影响。把胃癌患者分成术后辅助化疗组和术后未进行辅助化疗组,每组分Lin28阳性组和Lin28阴性组进行生存率分析。生存分析显示,在术后接受辅助化疗患者中五年无病生存率Lin28阳性组为56.7%；Lin28阴性组为66.2%（P=0.014）。五年总生存率Lin28阳性组为66.8%；Lin28阴性组为70.4%（P=0.019）。分层分析多元回归分析,结果显示Lin28在术后辅助化疗的患者中是独立的预后因子。在未进行术后辅助化疗患者中,Lin28阳性患者预后有较差的趋势,但是没有统计学意义。结果提示,Lin28影响胃癌患者预后可能是通过影响化疗疗效来实现的。结论：体内体外实验结果均提示,Lin28可以诱导胃癌细胞化疗耐药。体内实验提示抑制胃癌细胞中Lin28表达可能是逆转胃癌化疗耐药的途径之一。同时,Lin28抑制Let-7a、Let-7b、Let-7c、miR-107等miRNA表达可能是Lin28诱导化疗耐药的机制之一。在新辅助化疗患者中Lin28可以作为预测化疗疗效的基因之一。Lin28在胃癌组织中的表达与胃癌患者复发/转移相关,多元回归分析发现Lin28是预后的独立因子,分层分析发现Lin28在术后辅助化疗的患者中是预后的独立影响因子,而在未接受术后辅助化疗的患者中与预后无明显相关。因此,Lin28影响胃癌患者预后,可能是通过影响化疗疗效来实现的。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语及中英文对照
• 目次
• 前言
• 主要仪器设备
• 主要实验材料
• 实验试剂的配制
• 第一部分 稳定表达Lin28胃癌细胞的构建以及Lin28与胃癌细胞化疗耐药相关性的体外研究
• 1. 前言
• 2. 技术路线
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 第二部分 Lin28表达与胃癌新辅助化疗后病理反应的相关性分析
• 1. 前言
• 2. 技术路线
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 第三部分 Lin28在胃癌及癌旁正常组织中表达水平及在胃癌组织中Lin28表达水平与所有胃癌患者以及术后辅助化疗胃癌患者的预后相关性分析
• 1. 前言
• 2. 技术路线
• 3. 方法
• 4. 结果
• 5. 讨论
• 6. 结论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者学习经历及攻读学位期间发表主要论文