杆状病毒基因组扫描技术筛选病毒因子和顺式元件及其表达系统的应用

论文摘要

利用半补齐法构建了BmNPV基因组随机文库。将BmNPV DNA用Sau3A Ⅰ部分酶切,用Sal Ⅰ完全消化质粒载体pUC19,分别以Klenow酶半补齐,连接、转化后得到覆盖率大于99.9%的文库。通过与文库质粒DNA逐个共转染,鉴定了作用于早期基因helicase启动子的反式激活因子。筛选出的质粒均含有完整的ie-1基因。PCR克隆出ie-1基因共转染即可产生反式激活作用。为证实文库筛选的可靠性,分别克隆了其它主要早期基因并证实产物均不能对helicase启动子产生反式激活作用。瞬时表达分析表明,IE-1还可以对其它不同来源的启动子产生强烈的反式激活。 BmNPV hr3增强子的质粒不能激活另一报告质粒上的luc基因表达,但当细胞受到病毒感染时,便会强烈增强报告基因的表达。利用分别含有hr3的质粒、helicase启动子与luc基因的报告质粒和每个BmNPV随机文库质粒的DNA共转染家蚕细胞,结果显示杆状病毒的必需因子IE-1介导了hr3增强子在Bm细胞中的反式激活作用。进一步研究还证明IE-1因子作为蛋白质桥梁能使增强子对不同来源的启动子发挥广谱性的反式作用。这种增强子的反式作用一股能使转录活性提高40-100多倍。30bp回文序列是hr增强子反式激活中起作用的基本单元。利用文库共转染筛选时发现一个较小的质粒能反式激活转录几十倍,其不包含任何病毒早期基因,但包含ie-1基因的5’侧翼非编码序列直至起始密码子上游19bp处。瞬时表达证实378bp的ie-1启动子序列能反式增强启动子转录40-100倍,说明此378 bp ie-1启动子中存在编码某个因子或存在某未知调控方式的一段序列。将此378 bp ie-1启动子分为不同长度片段以及定点突变证明并非编码因子造成这种反式激活。推测这种转录激活现象是增强序列的反式作用。而介导这种反式作用的蛋白是来源于宿主的细胞因子。将一段238 bp序列分别顺式连接于报告质粒的启动子上游或报告基因的下游后发现其可以不分正反,不分上下游并能远距离的增强目的启动子转录10,000倍以上。为了检测此非同源重复区增强子（non-homologous region enhancer,NHE）对不同启动子的增强活性,将其分别顺式连接至杆状病毒晚期启动子和哺乳动物病毒来源的启动子,发现NHE对它们都能发挥很强的增强作用。另外,通过构建同时含有同源重复和非同源重复这两种类型增强子的报告质粒转染后证实两种类型增强子能够协同作用于报告基因的转录。通过将杆状病毒转移载体中的polyhedrin启动子替换为ie-1启动子,利用opa为报告基因,再将hr3增强子克隆于opd基因下游构建表达载体。共转染获得包含上述表达盒的重组病毒,通过对表达的OPD活性分析证明,该表达盒具有良好的表达效果。将Pfu DNA聚合酶基因（PfuPol）克隆入转移载体使其处于多角体启动子控制之下。共转染获得重组病毒用于感染家蚕。SDS-PAGE分析显示表达的重组蛋白约90kD,将产物经一步法热变性后即可直接用于高保真PCR中。每毫升血淋巴中Pfu DNA聚合酶活性为2×105U。

论文目录

第一章基因表达调控中的启动子与增强子元件

1.1 启动子元件及其研究方法

1.1.1 启动子的组成元件

1.1.2 启动子相关的研究方法

1.2.增强子元件及其相关研究方法

1.2.1 增强子的结构与作用特点

1.2.2 增强子的功能及其作用方式

第二章研究目的与内容

2.1 研究目的

2.2 研究内容

2.2.1 半补齐法构建BmNPV基因组文库

2.2.2 利用BmNPV基因组文库筛选反式激活因子及文库功能评价

2.2.3 介导同源重复区增强子反式激活作用的病毒因子的鉴定

2.2.4 杆状病毒新型非hr增强子的发现及其功能研究

2.2.5 利用立即早期ie-1启动子与hr3增强子构建的新型杆状病毒表达载体

2.2.6 Pfu DNA聚合酶基因的克隆、表达及其在高保真PCR中的应用

2.3 研究意义

2.3.1 半补齐法构建BmNPV基因组文库

2.3.2 利用BmNPV文库筛选反式激活因子

2.3.3 病毒因子IE-1介导同源重复区增强子反式激活作用

2.3.4 杆状病毒非同源重复区增强子的发现及其增强作用研究

2.3.5 携带增强子的新型杆状病毒载体表达效果研究

2.3.6 利用家蚕表达Pfu DNA聚合酶以及表达产物在高保真PCR中的应用

第三章材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 质粒和菌种

3.1.2 病毒株、昆虫细胞和家蚕

3.1.3 酶试剂及试剂盒

3.1.4 其它主要试剂

3.1.5 细菌培养基

3.1.6 昆虫细胞培养基

3.1.7 常用溶液及缓冲液

3.1.8 所用主要仪器和设备

3.2 实验方法

3.2.1 细胞的传代

3.2.2 细胞的冻存

3.2.3 细胞的复苏

3.2.4 功能质粒由脂质体介导在昆虫细胞中的转染

3.2.5 功能质粒在细胞或家蚕幼虫中转染后的病毒反式激活处理

3.2.6 细胞的病毒感染

3.2.7 亲本病毒共转染

3.2.8 重组病毒的筛选和鉴定

3.2.9 细胞计数

3.2.10 碱法少量快速抽提质粒DNA

3.2.11 碱法大量制备质粒DNA

3.2.12 限制性内切酶反应

3.2.13 玻璃奶法纯化回收DNA片段

3.2.14 DNA的连接

3.2.15 质粒DNA的转化

3.2.16 重组质粒的鉴定

3.2.17 BmNPV包涵体病毒基因组DNA的制备

3.2.18 游离病毒基因组DNA的制备

3.2.19 病毒滴度的测定

3.2.20 荧光素酶分析

3.2.21 DNA浓度测定

第四章半补齐法构建BmNPV基因组文库

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与讨论

第五章用BmNPV随机文库筛选杆状病毒因子的研究

5.1 材料与方法

5.1.1 转染质粒

5.1.2 昆虫细胞转染效率内参系统的建立

5.1.3 24孔细胞培养板转染实验实现对文库的高通量筛选

5.1.4 主要早期基因的扩增与克隆

5.2 结果

5.2.1 转染效率内参系统的建立

5.2.2 利用文库筛选helicase启动子的反式激活因子

5.2.3 ie-1及其它主要早期基因的克隆及其产物的反式激活效果

5.2.4 IE-1对其它米源启动子的反式激活作用

5.3 讨论

第六章 IE-1因子介导同源重复区hr3发挥增强子反式激活作用

6.1 材料与方法

6.2 结果

6.2.1 病毒介导下hr3增强子能发挥反式作用

6.2.2 随机文库筛选介导hr3增强子发挥反式作用的病毒因子

6.2.3 同源重复区增强子在反式作用中的结构单元

6.3 讨论

第七章杆状病毒非同源重复区增强子的发现及其功能鉴定

7.1 材料与方法

7.1.1 文库及其它质粒的构建

7.1.2 ie-1启动子不同长度亚片段的扩增及克隆

7.1.3 238 bp ie-1启动子亚片段与不同启动子报告质粒的顺式连接载体构建

7.1.4 同时含有238 bp片段与同源重复区增强子报告质粒的构建

7.1.5 此238 bp元件在Sf细胞以及家蚕活体中的功能分析

7.1.6 转染、共转染

7.2 结果

7.2.1 BmNPV随机文库92#质粒DNA具有反式激活靶启动子转录活性

7.2.2 378 bp ie-1启动子质粒具有反式激活靶启动子的能力

7.2.3 ie-1启动子不同长度亚片段在反式激活中的作用

7.2.4 顺式构象下对靶启动子的激活作用

7.2.5 NHE能识别多种类型启动子

7.2.6 NHE能与同源重复区增强子协同作用于靶启动子

7.2.7 NHE在Sf细胞以及家蚕活体中的增强作用

7.3 讨论

第八章利用极早期启动子与增强子构建新型杆状病毒表达载体的研究

8.1 材料与方法

8.1.1 材料

8.1.2 新型表达载体的构建

8.1.3 重组病毒的获得

8.1.4 OPD在家蚕BEVS中的表达

8.1.5 OPD酶活性测定

8.1.6 标准曲线制作

8.2 结果

8.2.1 含ie-1启动子与hr3增强子的转移载体构建

8.2.2 同源重组及重组病毒的筛选

8.2.3 重组病毒在家蚕中的表达及活力测定

8.3 讨论

第九章 Pfu DNA聚合酶基因的克隆、表达及其在高保真PCR中的应用

9.1 材料和方法

9.1.1 材料

9.1.2 Pyrococcus furiosus培养以及基因组DNA提取

9.1.3 Pfu DNA polymerase基因的扩增及转移载体构建

9.1.4 重组病毒的获得

9.1.5 Pfu DNA聚合酶在家蚕BEVS中的表达

9.1.6 一步法热变性纯化Pfu DNA聚合酶及其SDS-PAGE电泳

9.1.7 Pfu DNA聚合酶在高保真PCR中的应用

9.2 结果

9.2.1 Pfu DNA聚合酶基因的克隆

9.2.2 含Pfu DNA聚合酶基因的重组BmNPV的获得

9.2.3 重组病毒在家蚕中的表达及一步法纯化Pfu DNA聚合酶

9.2.4 SDS-PAGE电泳分析

9.2.5 Pfu DNA聚合酶在高保真PCR中的应用

9.3 讨论

第十章结论

10.1 半补齐法构建BmNPV基因组随机文库

10.2 用BmNPV随机文库筛选杆状病毒因子

10.3 IE-1因子介导同源重复区hr3发挥增强子反式激活作用

10.4 杆状病毒非同源重复区增强子的发现及其功能鉴定

10.5 利用极早期启动子与增强子构建新型杆状病毒表达载体的研究

10.6 Pfu DNA聚合酶基因的克隆、表达及其在高保真PCR中的应用

参考文献

致谢

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