磷脂酶Dα1基因调控植物抗旱性的作用途径研究

论文摘要

我国水资源严重短缺，干旱灾害日益严重，已经成为制约农业和社会发展的重要因素。发展节水农业，提高有限水资源的利用效率，是缓解水资源危机，实现农业可持续发展的必由之路。加强作物抗旱与高效用水机理的研究，发掘植物抗旱节水基因资源，增强作物自身的水分利用效率和抗旱性潜力，是生物性节水技术开发的核心目标。磷脂酶D（Phospholipase D，PLD），是植物中存在的一类重要的跨膜信号转导酶类，参与植株的生物与非生物逆境胁迫反应。本研究利用农杆菌介导法将PLD1基因的超表达载体和RNA干涉载体转化入84k杨（银白杨×腺毛杨），通过对转基因株系进行PCR检测及Southern blot分析，证明目的基因片段已经整合到84K杨的染色体中，成功获得PLD1基因超表达（OE）植株以及PLD1基因RNA干涉（RNAi）植株。将OE型植株、RNAi型植株及野生型（WT）植株三种材料在温室中利用盆栽实验，进行水分胁迫处理和表型抗旱性鉴定。结果发现，与WT相比，OE型植株抗旱性较提高，RNAi型植株抗旱性则下降，表明PLD1基因对植物的抗旱性有正调节作用。在水分胁迫处理后对三种基因型植株的渗透调节能力、气孔调节特性、细胞膜脂质组和信号离子流速进行测定，分析PLD1基因调控植物抗旱性的作用途径，主要结果如下：（1）水分胁迫处理后，三种基因型之间饱和渗透势与渗透调节能力没有显著差异，表明PLD1基因不是通过参与植物的渗透调节途径提高植株的抗旱性。（2）水分胁迫条件下，与WT相比，OE型植株的气孔导度下降幅度较大，蒸腾失水速率减小，RNAi型植株气孔导度下降幅度较小，蒸腾失水速率高。这一结果表明，PLD1基因通过参与水分胁迫条件下的气孔调节作用影响植物的抗旱性。（3）利用非损伤微测技术检测三种基因型植株根部分生区域Ca2+、H+、K+三种信号离子的流速，发现水分胁迫条件下，OE型植株的Ca2+流速明显高于RNAi型植株，同时OE型植株H+的内流流速也大于RNAi型植株，进一步证明PLD1基因参与干旱信号的转导途径。通过本研究，可以初步推定植物中存在这一信号转导途径：胞外水分胁迫信号—跨膜信号转导酶PLD1—Ca2+—气孔调节—调控抗旱性。抑制PLD1的表达，使其参与的信号转导途径部分受阻，气孔调节受到抑制，导致蒸腾失水量大，植株抗旱性减弱。（4）在水分胁迫条件下三种基因型细胞膜脂质组学分析发现，PLD1酶在活体条件下优先水解PC，导致OE型植株中PC含量较RNAi型植株显著降低，PA含量则明显提高,这种脂质组成变化不利于细胞膜的稳定性。但是，从植株生长量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率的变化来看，超表达PLD1增强了植株的抗旱性。PLD酶兼具脂质降解和信号转导双重功能。这一结果表明，在水分胁迫条件下，PLD1酶的信号转导功能发挥主导作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 图目录
• 表目录
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景及研究目的
• 1.2 植物磷脂酶 D 及其抗逆机理研究进展
• 1.2.1 PLD 基因的分类
• 1.2.2 PLD 的结构特点与功能分析
• 1.2.3 PLD 的酶反应特性
• 1.2.4 PLD 的活性调控
• 1.2.5 PLD 的底物专一性
• 1.2.6 PLDs 在植物逆境胁迫中的分子生物学机理
• 1.3 脂质组学研究进展
• 1.3.1 脂质组的分析手段
• 1.3.2 应用 ESI-MS/MS 技术的植物脂质组学研究进展
• 1.4 杨树抗旱耐盐基因研究进展
• 第二章 PLD 1 基因超表达及 RNA 干涉 84K 杨的获得
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验植物材料
• 2.1.2 实验菌株及载体构建
• 2.2 引物、工具酶与主要试剂
• 2.2.1 引物与工具酶
• 2.2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器与设备
• 2.4 各种试剂的配制
• 2.4.1 组培中 MS 培养基各种母液的配制及保存
• 2.4.2 植物激素 NAA 和 6-BA 配制
• 2.4.3 抗生素母液及 5×TBE 的配制与保存
• 2.5 多种培养基的配制与灭菌
• 2.6 实验方法
• 2.6.1 野生型组培苗的扩繁培养
• 2.6.2 农杆菌菌株的活化培养
• 2.6.3 卡那霉素的敏感性试验
• 2.6.4 外植体的侵染及共培养
• 2.6.5 抗生素筛选
• 2.6.6 转化植株的扩繁
• 2.6.7 抗性植株的 PCR 检测
• 2.6.8 DNA 凝胶电泳
• 2.6.9 转膜
• 2.6.10 杂交
• 2.7 体系优化及检测结果
• 2.7.1 卡那霉素本地浓度的确定
• 2.7.2 抑菌性抗生素的选择
• 2.7.3 抗性芽的筛选
• 2.7.4 抗性植株的获得
• 2.7.5 抗性植株的 PCR 检测
• 2.7.6 Southern 检测
• 第三章 PLD 1 调控植物抗旱性的作用途径分析
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验药品及仪器
• 3.3 实验设计
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 组培苗移栽
• 3.4.2 抗旱性指标测定
• 3.4.3 数据处理及分析
• 3.5 实验结果与分析
• 3.5.1 转 PLD 1 基因 84 杨抗旱性评价
• 3.5.2 转 PLD 1 基因 84K 杨渗透调节能力分析
• 3.5.3 转 PLD 1 基因 84K 杨气孔调节能力分析
• 3.5.4 转 PLD 1 基因 84K 杨细胞信号离子流速分析
• 3.5.5 转 PLD 1 基因 84K 杨细胞膜脂质组学分析
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 农杆菌介导法获得转基因材料
• 4.2 卡那霉素筛选 84K 杨转化植株
• 4.3 转基因植株的分子生物学鉴定
• 4.4 PLD 1 基因调控植物抗旱性的作用途径
• 4.5 实验的不足及改进
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历