脂筏聚集及其与CaSR，FKBP12.6的共定位在哮喘细胞因子所致气道上皮细胞钙振荡中的作用

论文摘要

钙振荡（calcium oscillation）是胞浆游离钙的一种较为普通的运动形式,有着很重要的生物学意义,参与体内许多生理病理反应。支气管哮喘（简称哮喘）是一种慢性气道炎症性疾病,与多种炎性细胞及炎症介质有关。气道上皮细胞是气道炎症的主要效应细胞,参与介导气道内各种炎性细胞的生存、趋化和活化。Th2类细胞因子白介素-13（IL-13）、白介素-4（IL-4）在哮喘的发生、发展过程中发挥了重要作用。IL-13是体内上皮细胞增生和黏液过度分泌的主要调节者。IL-4在哮喘发生的各个环节均起着重要的作用。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是哮喘炎症过程中重要的启动因子,可诱导一系列细胞因子的产生。本研究用这三种细胞因子刺激气道上皮细胞,研究哮喘细胞因子所致的气道上皮细胞钙振荡的变化及其机制。脂筏由丰富的鞘脂、胆固醇和酰化的蛋白质动态聚集而成,形成相对稳定的具有一定功能的筏结构漂浮于二维流动的细胞脂膜中。在信号转导中发挥重要的作用,可能也参与钙信号传导过程。FK506结合蛋白12.6（FKBP12.6）是免疫抑制蛋白超家族的主要成员,具有对内质网钙释放通道RyR2的稳定作用。钙敏感受体（calcium sensing receptor,CaSR）属G蛋白偶联受体家族,通过感受细胞外钙的变化而调节机体Ca2稳态。推测脂筏形成及其与FKBP12.6和CaSR的相互作用可能参与哮喘细胞因子引起的气道上皮细胞钙振荡的调控。目的本研究通过检测哮喘细胞因子IL-4,IL-13,TNF-α所致人气道上皮细胞（human bronchial epithelial cell, HBE）的钙振荡变化,脂筏（lipid rafts）在细胞因子刺激后的聚集,及FKBP12.6、CaSR与脂筏的共定位,研究脂筏与FKBP12.6,CaSR在哮喘细胞因子引起的钙振荡中的作用。以探讨脂筏在哮喘发病机制中的作用,为临床预防和治疗哮喘提供新的思路和实验依据。方法1.分别用10ng/mlIL-4、IL-13和TNF-α处理人气道上皮细胞15min,用钙荧光指示剂FLUO-4标记后在激光共聚焦显微镜下检测胞浆内荧光强度的动态变化反映胞浆内游离钙的动态变化。观察细胞因子处理后,10μM组胺刺激引起的胞浆内游离钙的动态变化。2.细胞因子处理后固定细胞,用CaSR或FKBP12.6多克隆抗体进行免疫荧光染色,用Alexa Fluor488结合的霍乱毒素-B染色检测脂筏形成,在激光共聚焦显微镜下检测脂筏与FKBP12.6或CaSR的共定位。3.用FilipinⅢ抑制脂筏形成,检测细胞因子处理后组胺刺激引起的胞浆内游离钙的动态变化。结果1. 10ng/mlIL-4处理气道上皮细胞后,组胺诱发的钙振荡频率加快,振幅变小。检测到脂筏聚集明显,分别和FKBP12.6, CaSR有共定位。IL-4处理使CaSR核内分布明显减少,胞浆和胞膜的分布明显高于胞核,FKBP12.6蛋白主要表达于胞浆,而IL-4处理使FKBP12.6核内分布明显增多。2. 10ng/ml IL-13处理即诱发细胞发生钙振荡,再加入组胺刺激未诱发钙振荡。脂筏聚集不明显,CaSR核内分布明显减少,胞浆和胞膜的分布明显高于胞核。FKBP12.6的细胞内分布未发生明显改变。3. 10ng/ml TNF-α处理后,组胺刺激未诱发细胞钙振荡。检测到脂筏聚集明显,并与FKBP12.6和CaSR有共定位。CaSR的细胞内分布未发生明显改变,FKBP12.6核内分布明显增多。4.Filipin处理抑制脂筏形成后,组胺刺激未诱发细胞钙振荡,IL-4和TNF-α处理后组胺刺激也未诱发钙振荡。结论哮喘细胞因子IL-4作用于气道上皮细胞后,使组胺诱发的钙振荡频率加快,可能是脂筏与CaSR的联合作用,加快了钙信号的传导。IL-13处理引起的细胞钙振荡可能与CaSR的细胞内分布改变有关,与脂筏无关。

论文目录

• 一、主要缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、正文
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五、综述
• 参考文献
• 六、致谢