猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白假型病毒体系的建立

论文摘要

本试验利用RT-PCR方法分别克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）河南分离株Hn-1/06 GP5和GP6基因,并进行了遗传变异分析,结果表明该分离株的核苷酸序列和氨基酸序列与美洲型标准株VR2332的同源性分别为89.6%和89.5%;与国内江西分离株JX0612的同源性分别为97.4%和96.0%。将GP5、GP6基因克隆入真核表达载体pcDNA3.0,分别构建pcDNA-GP5单表达载体、pcDNA-GP5-GP6串联表达载体和pcDNA-GP5/6共表达载体,运用磷酸钙方法分别瞬时转染人胚肾细胞293T,48h后收集细胞,与抗PRRSV特异性血清及荧光素标记羊抗猪二抗反应,用流式细胞仪检测,GP5蛋白在293T细胞表面获得表达,共表达重组质粒的GP5蛋白荧光标记细胞数达到48.5%;单一GP5重组质粒的GP5蛋白荧光标记细胞数达到33%;串联表达重组质粒的GP5蛋白表达标记细胞数很少,仅为7.3%。该试验结果说明PRRSV GP5蛋白和M蛋白异源二聚体的形成是对GP5蛋白的转运、定位是有影响的。将构建好的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5/6重组质粒分别与鼠白血病病毒（MuLV）病毒假型构建体系的两种质粒pHIT60（包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol）和pHIT111（为MuLV的基因组及报告基因LacZ）瞬时共转染人胚肾细胞293T,48h后收获PRRS病毒假型粒子,超速离心浓缩病毒粒子,SDS-PAGE电泳,与抗GP5特异性血清及辣根过氧化物酶标记二抗反应,Western blot证实GP5蛋白在病毒假型颗粒表面表达,GP5蛋白整合到病毒假型粒子表面。将病毒假型粒子感染Marc-145和猪肺巨噬细胞（PAM）等不同的靶细胞,48h后检测报告基因,证实所构建的病毒假型粒子有感染性,确定GP5基因编码蛋白与病毒感染有关的糖蛋白抗原;同时发现由M蛋白介导GP5蛋白假型病毒颗粒的感染低度比单一GP5蛋白假型病毒颗粒感染低度高。本研究通过Western blot试验发现GP5蛋白在形成的病毒假型颗粒表面获得表达。通过感染性试验发现,其形成的假型病毒具有感染性,能够感染其宿主细胞,说明在细胞表面有PRRSV GP5蛋白的受体。经过Western blot和感染性试验证明我们已经成功构建了PRRSV的MuLV假型病毒体系,为研究PRRSV侵入细胞的机理提供了一个手段,为研究其在受体特性和组织嗜性上的变异提供了一个技术平台,也为研究PRRSV疫苗及治疗性药物具有重要的指导意义,为控制PRRS打下理论基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 文献综述
• 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
• 2 假型病毒技术研究进展
• 试验一 猪繁殖和呼吸综合征病毒河南分离株GP5基因的克隆及在293T细胞中表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验二 猪繁殖和呼吸综合征病毒河南分离株GP5重组载体构建及在293T细胞中表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验三 整合猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的重组鼠白血病病毒特性
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验四 猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白介导的E蛋白假型鼠白血病病毒的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 发表论文
• 附录