犬瘟热病毒的分离及单克隆抗体的研制

论文摘要

犬瘟热（CD）是一种由犬瘟热病毒（CDV）引起的犬急性传染病。CDV属于副粘病毒科的麻疹病毒属。主要引起犬科、鼬科和浣熊科动物犬瘟热的发生,大熊猫和小熊猫等我国珍稀野生动物也不能幸免。但是伴随生态环境的变化和CDV对动物流行病因素的适应,它的自然感染宿主范围在不断扩大。一、表达犬CD150的Vero细胞系的建立及犬瘟热病毒的分离犬瘟热病毒的分离和培养是确诊犬瘟热的最根本方法,选择适合的细胞是分离和培养的关键。目前,在用Vero细胞系进行CDV分离和培养时,需要传代数次或添加胰酶,才有可能产生细胞病变,而有些CDV毒株经处理后仍不能产生细胞病变,这样就给CDV的研究带来不便。有报道称,淋巴细胞活化信号分子（SLAM,CD150）是CDV等病毒的受体。本研究通过PCR技术扩增犬白细胞中的CD150基因,构建真核表达载体pIRES-CD150,转染Vero细胞,利用G418进行筛选,挑取单个细胞克隆进行培养,建立了Vero-CD150细胞系。通过PCR技术和流式细胞术对Vero-CD150细胞系进行鉴定,同时检测该细胞系的遗传稳定性和培养特性,发现该细胞系培养方法与Vero细胞相似,且多次传代复苏后,仍能稳定表达CD150基因。利用Vero-CD150细胞系分离CDV,出现明显的细胞病变,且通过RT-PCR技术扩增出病毒的特异性片段,将分离到的一株CDV命名为CDV0701株。二、犬瘟热病毒H、F基因的原核表达及单克隆抗体的制备利用PCR技术,扩增出CDV0701株血凝素蛋白（H）基因以及融合蛋白（F）基因,将H基因和F基因分别插入原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因的下游,获得重组质粒pGEX-H和pGEX-F。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析表明,重组菌能正确表达GST-H和GST-F融合蛋白。分别以纯化的融合蛋白GST-H和GST-F免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。获得2株针对CDV H蛋白的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为4A10和2D5,其腹水型效价分别为2.56×104、2.56×104;获得3株针对CDV F蛋白的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为3E10、5F9和1G2,其腹水型效价分别为1.28×104、1.28×104、2.56×104。ELISA和Western-blot分析结果显示,以上5株单抗仅与对应的蛋白质反应,而与原核表达载体pGEX-6P-1蛋白不反应。间接免疫荧光试验显示,5株单抗均能与感染了CDV0701株的Vero-CD150细胞发生反应。这5株单抗的获得为进一步研究CDV H蛋白和F蛋白的功能,及建立检测CDV的方法提供了工具。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 1 病原特征
• 2 宿主范围
• 3 流行病学特点
• 4 CDV 致病机理和 CD 的临床症状
• 5 犬瘟热病毒的分离培养
• 6 犬瘟热病毒的诊断
• 7 CD 的防制
• 8 重要的公共卫生意义
• 第一章 表达犬CD150基因的Vero细胞系的建立及犬瘟热的分离
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二章 犬瘟热病毒H、F 蛋白单克隆抗体的制备
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢