“靶位定向攻击”治疗肌无力症的新思路——工程化方法制备特异性抗原及其免疫性能分析

论文题目: “靶位定向攻击”治疗肌无力症的新思路——工程化方法制备特异性抗原及其免疫性能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 郭晨云

导师: 袁静明

关键词: 乙酰胆碱受体亚基,重症肌无力,重组免疫吸附剂,内蛋白子介导的蛋白质连接,基因免疫

文献来源: 山西大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor,AChR）是一种配体介导的离子通道蛋白,由2α,β,γ（ε）δ共5个亚基组成。其中成熟的α亚基是自身免疫病重症肌无力（Myasthenia Gravis,MG）的主要免疫原,重症肌无力患者由于自身免疫系统的紊乱,体内产生了非正常的乙酰胆碱受体抗体,该抗体可与乙酰胆碱受体的α67-76,α125-147,α183-200氨基酸残基结合,减少功能性乙酰胆碱受体数量,抑制乙酰胆碱受体与乙酰胆碱结合,阻碍骨骼肌间神经传导。因此,长期以来,科学家们一直以AChR α-亚基N-端主要功能区片段为研究对象,从不同角度探讨MG的发病机理及其治疗的可能手段。本论文在前期工作的基础,着重进行了以下几个方面的研究。 AChRα205读框被克隆到含不同启动子的表达载体中（如pUC118,pET32M,pMAL-c2等）中,并在E. coli BL21中进行表达,其中目的蛋白只有在重组菌E. coli BL21/pMAL-AChRα205中获得了可溶性表达产物MBP-AChRα205,表达量可达到细胞总蛋白的30%,这也是国内外第一次获得AChR α亚基主要功能区的可溶性表达。经Amylose亲和纯化获得了融合蛋白MBP-AChRα205,而且经Factor Xa拆除可获得单一的AChRα205。同时,偶联在Amylose的MBP-AChRα205可作为一种免疫吸附剂。对小鼠抗AChR血清的免疫吸附实验表明,大约75%-98%的AChRAb可以被特异性清除,而血清蛋白、IgG、IgM、IgA仍能维持在正常水平。2例MG病人血清经该免疫吸附剂吸附后,AChRAb的清除率可达90%以上,清除效率要比那些化学合成的免疫吸附剂高的多。ELISA验证在免疫吸附过程中,没有MBP-AChRα205或AChRα205的脱落。 同时,我们也将目的基因片段延伸到AChRα211,并克隆到酵母表达载体pVT、pGAPZαA、pPIC9K中,转入酿酒酵母和毕赤酵母中进行分泌型表达。实验结果表明,重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K- AChRα211可以分泌表达有功能活性的目的蛋白,表达量可达到25mg/L。经阴离子交换层析和凝胶过滤层析,可获得电泳纯目的蛋白,并制备成免疫吸附剂,对两例肌无力患者血清中的AChRAb清除率可分别达到84%和94%。

论文目录:

第一章 乙酰胆碱受体与重症肌无力(综述)

1 前言

2 乙酰胆碱受体结构与功能

2.1 乙酰胆碱受体的结构

2.2 乙酰胆碱受体的作用机理

2.3 乙酰胆碱受体结构与功能的关系

3 重症肌无力发病机理及治疗方法

3.1 重症肌无力形成机理

3.2 重症肌无力的细胞免疫机理

3.3 重症肌无力的治疗方法

4 重症肌无力治疗的新战略—免疫毒素

4.1 核糖体失活蛋白

4.2 免疫毒素

5 参考文献

第二章 乙酰胆碱受体主要功能区的延伸与分子亚克隆

1 前言

2 材料

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂

2.3 主要试剂配制

2.4 菌种和质粒

3 方法

3.1 寡核甘酸片段的双链形成

3.2 重组质粒pUC-AChR_(α205)的分子克隆

3.3 重组质粒的鉴定

3.4 工程菌的诱导与表达

4 结果

4.1 DNA片段双链的合成

4.2 重组质粒pUC-AChR_(α205)的鉴定

4.3 目的基因的序列分析

4.4 重组质粒在E.coli DH5α中的初步表达

5 讨论

6 参考文献

第三章 乙酰胆碱受体α亚基主要功能区在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及免疫活性

1 前言

2 材料

2.1 主要仪器设备

2.2 主要试剂及配制

2.3 菌种与质粒

3 方法

3.1 AChR_(α205)基因片段的克隆及重组子的构建

3.2 目的蛋白在不同重组菌的表达

3.3 MBP-AChR_(α205)融合蛋白的表达和纯化

3.4 MBP-AChR_(α205)和AChR_(α205)蛋白的免疫学性质

3.5 免疫吸附剂的制备及其吸附性能

4 结果

4.1 重组子的双酶切鉴定

4.2 AChR_(α205)在不同表达载体中的表达

4.3 融合蛋白MBP-AChR_(α205)的纯化

4.4 融合蛋白MBP-AChR_(α205)的Factor Xa酶切

4.5 融合蛋白MBP-AChR_(α205)与Factor Xa酶切产物的Western blot印迹

4.6 融合蛋白MBP-AChR_(α205)与Factor Xa酶切产物的ELISA检测

4.7 融合蛋白MBP-AChR_(α205)与抗AChR血清的ELISA反应

4.8 免疫吸附剂Amylose-MBP-AChR_(α205)对AChRAb的结合性能

4.9 免疫吸附剂对肌无力病人血清中AChRAb及其它成分的清除率

5 讨论

6 参考文献

第四章 乙酰胆碱受体α-亚基主要功能区在酵母中的表达纯化及免疫性质

1 前言

2 材料

2.1 工具酶和主要生化试剂

2.2 免疫分析试剂

2.3 酵母菌培养基

3 方法

3.1 重组质粒的构建

3.2 酵母宿主菌感受态细胞的制备及转化

3.3 多拷贝酵母重组转化子的筛选

3.4 重组菌的PCR鉴定

3.5 重组AChR_(α211)在P.pastoris GS115中的分泌表达

3.6 重组AChR_(α211)的纯化

3.7 AChR_(α211)的免疫学活性

3.8 AChR_(α211)-免疫吸附剂的制备

3.9 AChR_(α211)-免疫吸附剂对肌无力患者血清中AChRAb的清除作用

4 结果

4.1 重组质粒的鉴定

4.2 重组酵母菌的PCR鉴定

4.3 重组AChR_(α211)的分泌表达及Western blot分析

4.4 重组AChR_(α211)的纯化及免疫活性

4.5 AChR_(α211)免疫吸附剂的制备及其对肌无力患者血清中AChRAb的清除

5 讨论

6 参考文献

第五章 蛋白质自剪接在蛋白质工程中的应用(综述)

1 前言

2 蛋白质自剪切现象的发现

3 蛋白质自剪接的术语及内蛋白子(intein)的命名

3.1 蛋白质自剪接术语

3.2 内蛋白子的命名

3.3 具有归位内切酶活性的内蛋白子的命名

4 内蛋白子的分布

5 内蛋白子的分类与性质

5.1 典型内蛋白子

5.2 微型内蛋白子

5.3 逆向剪接内蛋白子

6 内蛋白子自剪接机理

7 内蛋白子晶体结构研究概况

8 蛋白质剪接的进化

9 内蛋白子在蛋白质工程中的应用

9.1 内蛋白子协调的蛋白质间的“化学”合成

9.2 内蛋白子协调的蛋白质聚合与环化

9.3 利用内蛋白子的剪切性质建立重组蛋白的一步纯化系统

9.4 其它

10 参考文献

第六章 内蛋白子介导合成免疫毒素AChR_(α211)-Gelonin

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 重组质粒的构建

2.3 重组菌的诱导表达

2.4 重组蛋白的变、复性

2.5 Intein诱导的自剪切反应及目的蛋白的一步纯化

2.6 Western blot分析

2.7 ELISA分析

2.8 无细胞体系中蛋白质合成的抑制实验

3 结果与讨论

3.1 表达载体的构建

3.2 重组蛋白的诱导表达

3.3 包涵体的变性与复性

3.4 Intein的自剪切反应

3.5 表达及纯化产物的免疫活性分析

3.6 重组Gelonin的ELISA分析

3.7 重组Gelonin对无细胞体系蛋白质合成的抑制作用

3.8 Intein介导的免疫络合物AChR_(α211)-Gelonin的构建

4 讨论

5 参考文献

第七章 基因疫苗pcDNA-AChR_(α211)的构建及其在C57BL／6小鼠体内的体液免疫应答

1 前言

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.2 重组质粒的构建及其鉴定

2.3 重组质粒的大量提取及纯化

2.4 重组质粒的免疫接种

2.5 抗血清的制备

2.6 小鼠血清中AChRAb的ELISA检测

2.7 小鼠组织DNA的提取

2.8 PCR检测组织中的目的基因

3 结果

3.1 重组质粒pcDNA-AChR_(α211)的鉴定

3.2 重组质粒pcDNA-AChR_(α211)的纯化及定量

3.3 临床症状

3.4 血清中AChRAb的检测

3.5 组织中目的基因的检测及序列测定

4 讨论

5 参考文献

附录一 略语表

附录二 基本方法与技术

附录三 攻读博士期间发表的论文

致谢

承诺书

发布时间: 2005-08-31

参考文献

• [1].重症肌无力胸腺树突状细胞对AChR抗原提呈作用的研究[D]. 赵云平.第三军医大学2004
• [2].MG胸腺骨骼肌抗原表达及相应抗体改变的临床意义研究[D]. 刘朝普.第三军医大学2005
• [3].树突状细胞负载Tα146-162治疗EAMG的B细胞活化机制研究[D]. 王蓉.中南大学2007
• [4].scFvCD20负载antagomiR155治疗EAMG的实验研究[D]. 王玉忠.中南大学2012
• [5].Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子与重症肌无力病情严重程度相关性研究[D]. 桂梦翠.华中科技大学2015
• [6].腺苷A2A受体在实验性自身免疫性重症肌无力中的机制研究[D]. 李娜.哈尔滨医科大学2012
• [7].诱导重症肌无力模型新方法并研究可溶性促衰变因子对其的保护作用[D]. 孙辰婧.第四军医大学2013
• [8].诱导重症肌无力模型新方法并研究可溶性促衰变因子对其的保护作用[D]. 孙辰婧.第四军医大学2013
• [9].间充质干细胞输注治疗重症肌无力的实验研究[D]. 于靓霞.北京协和医学院2011
• [10].重症肌无力危象患者血清IL-17水平及其临床意义研究[D]. 林婧.华中科技大学2013

相关论文

• [1].重肌灵抗重症肌无力的主要药理作用及作用机制的研究[D]. 韩涛.北京中医药大学2003
• [2].P9-ZFD蛋白的表达、亚细胞定位及其在MG病因机制中的作用[D]. 任明山.复旦大学2003
• [3].重症肌无力胸腺树突状细胞对AChR抗原提呈作用的研究[D]. 赵云平.第三军医大学2004
• [4].胸腺瘤病理学和伴胸腺瘤重症肌无力临床诊治的研究[D]. 吴涛.第二军医大学2004
• [5].胸腺瘤在重症肌无力发病机制中的作用分析[D]. 刘会宁.山东大学2004
• [6].重症肌无力患者骨骼肌中减少的P25蛋白的分布和序列鉴定[D]. 都爱莲.复旦大学2005
• [7].MG胸腺骨骼肌抗原表达及相应抗体改变的临床意义研究[D]. 刘朝普.第三军医大学2005
• [8].重症肌无力患者肿瘤坏死因子α启动子-308等位基因多态性及体内外分泌活性的异常[D]. 管宇宙.中国协和医科大学2002
• [9].重症肌无力患者胸腺T淋巴细胞亚群免疫活性的研究[D]. 刘广志.中国协和医科大学2000
• [10].重症肌无力患者外周血单个核细胞糖皮质激素受体的研究[D]. 张星虎.中国协和医科大学2000

标签：乙酰胆碱受体亚基论文;  重症肌无力论文;  重组免疫吸附剂论文;  内蛋白子介导的蛋白质连接论文;  基因免疫论文;