氯通道阻断剂对Aβ诱导细胞凋亡的下调作用及其与JNK信号通路的关系

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种中枢神经系统的退行性疾病,其原因和发病机制至今未明。β淀粉样蛋白（amyloid proteinβ, Aβ）的神经毒作用是导致AD的共同通路,大量研究表明Aβ诱导的细胞凋亡是AD发病的重要病理生理学机制。细胞膜氯通道的激活可能是介导细胞凋亡的重要离子机制,本实验利用氯通道的阻断剂DIDS和Phloretin研究Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡这一AD模型中氯通道的作用。JNK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）中重要的通路之一,是参与应激诱导的细胞凋亡的重要信号转导机制,本实验初探Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡过程中是否有JNK蛋白的磷酸化激活,以及氯通道阻断剂DIDS和Phloretin与JNK的磷酸化激活的关系。由于Aβ诱导神经元凋亡的机制十分复杂,至今尚未找到可以抑制细胞凋亡的关键性靶点。因此,阐明机制找到靶点,将为AD的防治带来希望。目的:1.观察氯通道阻断剂DIDS能否抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,了解氯通道在Aβ诱导PC12细胞凋亡过程中的作用。2.观察对VSOR Cl-通道有相对特异性阻断作用的Phloretin能否抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,从而了解VSOR Cl-通道是否参与下调Aβ毒性作用。3.探讨JNK在Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡中的作用,以及氯通道阻断剂与JNK的关系。方法:1.以传代培养的PC12细胞为研究对象,实验设立阴性组（正常对照组）,阳性对照组（仅给Aβ25-35诱导细胞凋亡处理）,及实验组（Aβ25-35诱导细胞凋亡+氯通道阻断剂DIDS或Phloretin）。2.噻唑兰（3-（ 4, 5-dimethylthiazol-2-yl） -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT）比色法观察PC12细胞存活率;用荧光显微镜观察Hoechst33258荧光染色后的细胞核的形态学变化;采用荧光素检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）水平,反映PC12细胞膜完整性的改变;DNA琼脂糖凝胶电泳,检测PC12细胞凋亡的发生。3.采用Western Blot印迹法检测Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡时不同时间点P-JNK的表达和不同处理组P-JNK的表达。4.所有数据应用SPSS11.0统计软件进行数据分析处理。结果:1.实验结果验证了Aβ25-35作用于PC12细胞时细胞发生凋亡。并且发现DIDS和Phloretin能够有效地抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡。2. 40μmol/L Aβ25-35作用于PC12细胞（作用24 h）后,MTT实验显示细胞存活率（58.4 %±9.3 %）降低,与阳性对照组相比细胞存活率在Aβ25-35+DIDS组（86.0%±7.2%）或Aβ25-35+ Phloretin组（94.1%±9.3%）,均有增加,且差异有统计学意义（P < 0.01）。3. Hoechst33258荧光染色显示Aβ25-35作用于PC12细胞时,细胞出现明显的皱缩,胞核染色质断裂、聚集、固缩等典型的凋亡形态学变化,而实验组凋亡细胞明显减少。4. LDH释放水平:阴性组与Aβ25-35阳性对照组（433.1±41.5 U/L）比较差异有统计学意义（P < 0.01）;Aβ25-35阳性对照组与Aβ25-35+Phloretin实验组（354.4±34.3 U/L）比较差异有统计学意义（P < 0.01）;Aβ25-35阳性对照组与Aβ25-35 +DIDS实验组（366.7±28.3 U/L）,比较差异有统计学意义（P < 0.01）。5. DNA琼脂糖凝胶电泳结果:Aβ25-35阳性组可以见到明显的DNA“梯带”,阴性组和实验组没有DNA“梯带”。6. Western Blot印迹结果:6 h时Aβ25-35诱导PC12 P-JNK蛋白表达量增高,与0 h比较差异有统计学意义（P < 0.01）。两个实验组与阳性对照组比较,P-JNK蛋白表达量的差异均有统计学意义（P < 0.01）。结论:本研究表明:氯通道阻断剂DIDS和Phloretin可以抑制Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡,而且,应用氯通道阻断剂可使P-JNK表达降低。因相对特异性的VSOR Cl-通道阻断剂Phloretin可以对Aβ诱导的PC12细胞凋亡起到保护作用,从而推测VSOR Cl-通道在Aβ诱导PC12细胞凋亡时可能被激活。且推测氯通道阻断剂对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的下调作用是通过抑制JNK磷酸化实现的。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 一 Aβ 的神经毒作用
• 二 氯通道的主要分类及功能
• 三 氯通道与细胞凋亡
• 四 信号分子对氯通道介导细胞凋亡的调节
• 五 信号分子对 Aβ 诱导细胞凋亡的调节
• 六 Aβ 诱导神经元凋亡的离子机制
• 七 MAPK与神经系统疾病
• 八 JNK与AD
• 九 氯通道和疾病
• 正文 氯通道阻断剂对AΒ诱导细胞凋亡的下调作用及其与JNK信号通路的关系
• 引言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢