瑞士乳杆菌酪蛋白源活性肽制备及其生理功效研究

论文摘要

乳源生物活性肽是指含2～20个氨基酸残基肽类物质,具有抗氧化、免疫调节、抗高血压、调节细胞生长、抗血栓及离子载体等多种生物活性。它们包含在乳蛋白质母体中,只有通过一定的手段释放后才能发挥其功效,采用体外酶解或微生物发酵方式是目前获取乳蛋白活性肽的主要手段。瑞士乳杆菌属于同型发酵乳酸菌,有较好的产酸活性及蛋白水解活力,广泛用于多种乳制品的生产上。本项研究从瑞士乳杆菌菌株的筛选与分子鉴定、菌株蛋白水解活力的确定、酪蛋白水解产物生产工艺的优化、水解产物的纯化及最终生理功效评价等方面对利用菌体细胞水解酪蛋白制备活性肽技术进行了研究,主要研究结果如下:（1）基于生理生化和16S rRNA基因序列的实验数据,确定自传统发酵乳制品的4株乳杆菌（菌株L1、L2、L3和L4）分别是瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）2株、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）1株及嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）1株,并选取了2株瑞士乳杆菌为试验用株,分别命名为L. helveticus 9和L. helveticus 6。（2）基于菌落蛋白水解圈直径大小和酪蛋白水解度,比较了2株瑞士乳杆菌蛋白水解活力;测定了菌株L. helveticus 9在不同培养时间下的酪蛋白水解度及多肽含量,并对酪蛋白水解产物进行SDS-PAGE凝胶电泳和交联葡聚糖SephadexG-25层析鉴定。结果表明,菌株L. helveticus 9蛋白酶活力高于菌株L. helveticus 6;菌株L. helveticus 9对酪蛋白的水解作用随着时间的延长而逐渐递增,反映出菌株L. helveticus 9具有较高的蛋白酶活力。（3）基于酪蛋白水解度和多肽含量数据,研究了接种量、培养时间、培养温度及底物浓度与菌株L. helveticus 9水解酪蛋白间的相互关系。结果表明,菌株L. helveticus 9对酪蛋白的水解作用的最佳条件为:接种量为1×108cfu/mL,底物浓度为5%（w/v）,培养时间为48h,培养温度为37°C;酪蛋白的水解度可达17.33%,多肽含量达到0.62 mg/mL。显然,可以用具有较高蛋白水解活力的菌株L. helveticus 9从酪蛋白中制备潜在的生物活性肽。（4）利用超滤、葡聚糖凝胶SephadexG-25和SephadexG-15以及逆流色谱等手段对酪蛋白水解液逐步分离纯化出4个组分产物,即F3-1-1、F3-1-2、F3-2-1及F3-1-1-1。分离产物F3-1-1、F3-1-2和F3-2-1的质谱鉴定结果表明,组分F3-1-1是分子量在600～1300Da之间的一些小肽混合物;组分F3-1-2主要由氨基酸构成,并混杂极少的二肽或三肽的小分子肽段;组分F3-2-1基本是小分子氨基酸;组分F3-1-1-1的氨基酸序列为Glu-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro,分子量为1020.00Da。这些结果表明,利用上述分离手段可以实现酪蛋白水解产物短肽的分离纯化。（5）体外测试表明,L.helveticus 9细胞的酪蛋白水解产物对ACE有明显的抑制作用,且随着产物纯化程度的提高,其ACE抑制活性也随之增强,纯化后的ACE抑制肽的IC50为3.125mg/mL。对具有较高ACE抑制活性肽段的分子结构测定表明,该肽段的氨基酸序列为Glu-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro,其结构与目前发现的ACE抑制肽具有共性特征。（6）体外测试表明,L.helveticus 9细胞的酪蛋白水解产物具有一定抗氧化作用,能清除DPPH、羟基自由基及超氧自由基。当浓度为256.78μM时,纯化后的活性肽组分F3-1-1-1对羟基自由基清除率达到47.01%,该活性肽段的氨基酸序列为Glu-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro,其结构特征与目前发现的抗氧化肽具有一定共性特征。我们的研究表明,该活性肽段表现出功能多样性,既有一定的抗氧化活性,又具有一定的ACE抑制活性,具有潜在的应用前景。（7）L.helveticus 9酪蛋白水解产物具有一定降低肠细胞增殖、诱导细胞凋亡的功效。该功效具有剂量效应和纯度效应。5mg/mL的F3组分对Caco-2细胞增殖的抑制率达到33.72%,对IEC-6细胞增殖的抑制率达到8.91%。组分F3-1-1在5mg/mL浓度时,对Caco-2细胞增殖抑制率为41.12%,而对IEC-6细胞增殖抑制率仅为9.59%。TUNNEL和流式细胞仪测定结果表明:5mg/mL组分F3-1-1能诱导Caco-2细胞凋亡,凋亡率为14.93%;对IEC-6细胞诱导凋亡效果不明显。在相同剂量下,肽类混合物只能杀死肿瘤细胞,对正常细胞无毒副作用。这一结果提示,来源于乳蛋白的活性肽有望作为食品添加成分预防肠癌,降低患病的几率。（8）与目前普遍使用的酶解蛋白质工艺不同,我们建立了一条采用瑞士乳杆菌细胞水解酪蛋白获得生物活性肽的工艺技术。后续的试验结果表明,采用该工艺获得活性肽具有一定的生理功能,这从理论上证实了我们建立的工艺路线是可行的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 酪蛋白源活性肽研究进展
• 1.1 乳蛋白生物活性肽的定义及种类
• 1.2 酪蛋白结构及其来源活性肽的种类及序列来源
• 1.2.1 酪蛋白结构
• 1.2.2 酪蛋白分类
• s-酪蛋白'>1.2.2.1 α_s-酪蛋白
• 1.2.2.2 β-酪蛋白
• 1.2.2.3 κ-酪蛋白
• 1.2.3 牛乳酪蛋白的一级结构
• 1.2.4 酪蛋白源生物活性肽序列及功能
• 1.2.4.1 抗高血压肽
• 1.2.4.2 抗氧化肽
• 1.2.4.3 细胞生长调节肽
• 1.2.4.4 免疫调节肽
• 1.2.4.5 其它活性肽
• 1.3 利用乳蛋白制备生物活性肽的技术方法
• 1.3.1 获取乳蛋白生物活性肽采用的方法
• 1.3.1.1 酶解
• 1.3.1.2 微生物发酵法
• 1.3.1.3 化学合成法
• 1.3.1.4 采用基因工程技术
• 1.4 生物活性肽的分离纯化
• 1.4.1 超滤技术
• 1.4.2 离子交换色谱法
• 1.4.3 大小排阻层析和反相高压液相色谱
• 1.4.4 高速逆流色谱
• 1.5 乳源蛋白活性肽特定生理功效评价方式
• 1.6 技术应用前景
• 1.7 本论文主要研究目的意义及技术路线
• 2 瑞士乳杆菌的分离、鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 培养基
• 2.1.2.2 培养及形态特征
• 2.1.2.3 生理特征测试
• 2.1.2.4 生化特性测试
• 2.1.2.5 16S rRNA 基因的序列分析
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 乳杆菌的形态特征
• 2.2.2 乳杆菌的生理生化鉴定结果
• 2.2.3 菌株L1 和L2 16S rRNA 基因序列分析结果
• 2.2.3.1 菌株L1 和L2 基因组DNA
• 2.2.3.2 16S rRNA 基因特异性扩增结果
• 2.2.3.3 16S rRNA 基因的纯化
• 2.1.3.4 菌株 L1 16S rRNA 基因序列分析结果
• 2.2.3.5 菌株L2 16S rRNA 基因序列分析结果
• 2.3 讨论
• 3. 高蛋白水解活力瑞士乳杆菌的筛选
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌株
• 3.1.1.2 试剂
• 3.1.1.3 仪器
• 3.1.1.4 培养基
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 菌株蛋白水解活性初步检测即平板筛选法（初筛）
• 3.1.2.2 菌株对酪蛋白溶液的水解作用（复筛）
• 3.1.2.3 菌株L. helveticus 9 的酪蛋白水解进程测定
• 3.1.2.4 菌株L. helveticus 9 酪蛋白水解产物的分析鉴定
• 3.1.3 统计分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 蛋白水解酶产生菌的初步筛选结果
• 3.2.2 菌株对酪蛋白溶液的水解作用（复筛）结果
• 3.2.2.1 甘氨酸标准曲线
• 3.2.2.2 多肽的标准曲线
• 3.2.2.3 菌株酪蛋白水解溶液的水解度及多肽含量
• 3.2.3 菌株L. helveticus 9 对酪蛋白水解作用
• 3.2.4 L. helveticus 9 酪蛋白水解产物分析鉴定
• 3.2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.4.2 菌株L. helveticus 9 酪蛋白水解液凝胶层析图谱
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4. 瑞士乳杆菌水解酪蛋白发酵工艺的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 菌株与培养
• 4.1.1.2 试剂
• 4.1.1.3 培养基
• 4.1.2 仪器
• 4.1.3 方法
• 4.1.3.1 菌株Lactobacillus helveticus 9 酪蛋白水解工艺试验设计
• 4.1.3.2 测试指标及分析方法
• 4.1.4 统计分析
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 结果
• 4.2.1.1 菌株Lactobacillus helveticus 9 酪蛋白水解工艺的优化
• 4.2.1.2 验证实验
• 4.2.2 讨论
• 4.3 小结
• 5. 酪蛋白水解物的制备及分离纯化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 菌株
• 5.1.1.2 试剂
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 方法
• 5.1.3.1 L. helveticus 9 菌株酪蛋白水解产物的制备
• 5.1.3.2 L. helveticus 9 菌株酪蛋白水解产物的超滤分离
• 5.1.3.3 F3 组分SephadexG-25 凝胶过滤层析
• 5.1.3.4 SephadexG-15 交联葡聚糖凝胶进一步分离
• 5.1.3.5 SephadexG-15 交联葡聚糖凝胶分离谱峰的质谱鉴定
• 5.1.3.6 SephadexG-15 交联葡聚糖凝胶目标谱峰的高速逆流色谱分离
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 酪蛋白水解产物的超滤分离
• 5.2.2 F3 组分SephadexG-25 凝胶过滤层析
• 5.2.3 F3-1 和F3-2 组分SephadexG-15 层析
• 5.2.4 SephadexG-15 分离谱峰的质谱鉴定
• 5.2.5 F3-1-1 组分高速逆流色谱分离纯化结果
• 5.3 小结
• 6. 酪蛋白水解产物体外抑制ACE 作用的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.1.1 试剂
• 6.1.1.2 仪器
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 ACE 抑制活性的测定:
• 50) 的测定'>6.1.2.2 半抑制浓度( IC₅₀) 的测定
• 6.1.2.3 ACE 抑制肽分子结构特征的鉴定
• 6.2 结果
• 6.2.1 超滤产物抑制ACE 活性的效果
• 6.2.2 凝胶过滤分离产物抑制ACE 活性的效果
• 6.2.3 凝胶过滤分离产物抑制ACE 活性的效果
• 6.2.4 高速逆流色谱纯化产物抑制ACE 活性的效果
• 6.2.5 组分F3-1-1-1Q-TOF-MS/MS 鉴定结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 7. 酪蛋白水解产物体外抗氧化作用的研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.1.1 试剂
• 7.1.1.2 仪器
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 总的抗氧化能力的测定
• 7.1.2.2 酪蛋白水解产物还原能力的测定
• 7.1.2.3 酪蛋白水解产物清除羟自由基的测定
• 7.1.2.4 酪蛋白水解产物清除DPPH 自由基能力的测定
• 2^·-)清除能力的测定'>7.1.2.5 酪蛋白水解物对超氧阴离子自由基(O₂^·-)清除能力的测定
• 7.1.3 统计分析
• 7.2 结果
• 7.2.1 超滤产物抗氧化活性
• 7.2.1.1 还原能力
• 7.2.1.2 总抗氧化能力
• 7.2.1.3 清除羟基自由基能力
• 7.2.1.4 清除超氧自由基能力
• 7.2.1.5 清除DPPH 自由基能力
• 7.2.2 组分F3-1-1 和F3-1-2 清除自由基的能力
• 7.2.2.1 清除DPPH 自由基能力
• 7.2.2.2 清除羟基自由基能力
• 7.2.2.3 清除超氧自由基能力
• 7.2.3 高速逆流色谱分离纯化产物抗氧化作用
• 7.2.4 组分F3-1-1-1 分子结构及氨基酸序列
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 8. 酪蛋白水解产物调节肠细胞生长作用的研究
• 8.1 材料与方法
• 8.1.1 材料
• 8.1.1.1 试剂
• 8.1.1.2 仪器
• 8.1.2 方法
• 8.1.2.1 肠细胞（IEC-6 细胞、Caco-2 细胞）的培养
• 8.1.2.2 测定酪蛋白水解产物对肠细胞生长的作用
• 8.1.3 统计分析
• 8.2 结果
• 8.2.1 酪蛋白水解产物对肠细胞增殖的影响
• 8.2.1.1 超滤产物（F1、F2 和F3）对肠细胞增殖的影响
• 8.2.1.2 组分F3-1-1 和F3-1-2 对肠细胞增殖的影响
• 8.2.1.3 细胞凋亡形态的观察
• 8.2.1.4 TUNEL 试剂盒测定细胞凋亡的结果
• 8.2.1.5 流式细胞仪测定肠细胞凋亡的结果
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 9 结论与展望
• 9.1 菌种的分离及鉴定
• 9.2 高蛋白水解活力瑞士乳杆菌的筛选
• 9.3 水解酪蛋白发酵工艺的优化
• 9.4 酪蛋白水解物的制备及分离纯化
• 9.5 酪蛋白水解产物抑制ACE 作用的研究
• 9.6 酪蛋白水解产物抗氧化作用的研究
• 9.7 蛋白水解产物调节肠细胞生长作用的研究
• 9.8 本研究的创新点
• 9.9 展望
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 导师简介
• 获得成果目录清单
• 致谢