论文摘要
恶性肿瘤已成为人类的第一杀手,严重危害人类的生命健康。今后20年内全球癌症患者人数还将快速上升。目前,化疗是治疗肿瘤的最主要途径之一。然而肿瘤耐药往往造成化疗失败,从而导致患者病情恶化甚至死亡。统计数据表明,90%以上肿瘤患者的死亡与肿瘤耐药相关。因此,如何克服肿瘤耐药是成功治疗恶性肿瘤急需解决的关键问题之一肿瘤细胞株是肿瘤研究的重要工具。很多肿瘤相关的研究都不能以患者为直接作用对象,必须先以体外培养的肿瘤细胞株为研究对象进行研究和评估。体外建立肿瘤耐药细胞株可以为阐明肿瘤耐药机制和逆转肿瘤耐药奠定基础。本研究以人乳腺癌细胞BCap37为亲代细胞,以紫杉醇为筛选药物,使用两种不同的“两阶筛选法”成功建立乳腺癌耐药细胞株Bats-72和Bads-200.其中Bats-72是基于紫杉醇高剂量冲击诱导且时间递增的“两阶筛选法”建立,Bads-200是基于紫杉醇低剂量持续诱导且剂量递增的“两阶筛选法”建立。Bats-72和Bads-200的耐药性状存在相似之处。细胞鉴定发现Bats-72和Bads-200在体外增殖速度不同程度的慢于BCap37,但两者在体内的增殖速度均快于BCap37。相对于亲代细胞BCap37,Bats-72和Bads-200在体内和体外都不同程度地耐受紫杉醇介导的细胞毒性、细胞周期停滞和细胞凋亡。但是Bats-72和Bads-200的耐药性状存在显著差异。首先,Bats-72对MDR类化疗药物的耐受程度低于Bads-200;其次,Bats-72的耐药谱宽于Bads-200;最后,在无紫杉醇的培养条件下,Bats-72的耐药性长期稳定,而Bads-200的耐药性逐渐下降,直至完全消失。由此可见,新型乳腺癌耐药细胞Bats-72和Bads-200的起源相同、筛选药物也相同,只是建立方法不同,导致两者的耐药性状存在显著差异,分别代表着两种不同的耐药类型。BCap37, Bats-72和Bads-200这组细胞模型对系统地研究乳腺癌耐药具有一定的科研价值。为进一步阐明乳腺癌耐药机制和寻找潜在的可临床应用的肿瘤耐药逆转途径,本研究开展了一系列实验研究。ABC通道蛋白通过将化疗药物转运至细胞外,使细胞内始终维持较低的药物浓度,从而导致肿瘤细胞耐药,是最为经典的肿瘤耐药机制之一。文献报导与肿瘤耐药相关的ABC通道蛋白多达15种,其中P-gp、BCRP和MRP1介导的肿瘤耐药最为常见,相关的研究也最为深入。本研究发现ABC通道蛋白功能调节剂维拉帕米和粉防己碱可以有效逆转Bats-72和Bads-200的耐药性。这提示ABC通道蛋白可能参与介导Bats-72和Bads-200细胞耐药。通过cDNA表达谱芯片、RT-PCR和Western Blot等实验检测,我们研究发现ABC通道蛋白的表达差异对Bats-72和Bads-200的耐药特性起了关键作用。Bats-72和Bads-200均过表达ABCB1及其编码蛋白P-gp,但前者的表达量低于后者。这为Bats-72和Bads-200均耐受MDR类药物,但前者对MDR类化疗药物的耐受程度低于后者提供了理论依据。ABCG2和ABCC6只在Bats-72表达上调,从而介导Bats-72耐受甲氨蝶呤和吉西他滨等药物。这为Bats-72的耐药谱宽于Bads-200提供了理论依据。此外,在无紫杉醇的培养条件下,P-gp在Bats-72细胞中的表达长期稳定,而在Bads-200细胞中的表达逐渐下降。这为Bats-72的耐药性长期稳定,而Bads-200的耐药性逐渐下降,直至完全消失提供了理论依据。肿瘤耐药往往是多因素参与,多种耐药机制同时存在并相互影响。具体的耐药机制非常复杂,人们对其了解依然有限。研究已证实的肿瘤耐药靶蛋白有P-gp、BCRP、MRP1、拓扑异构酶Ⅱ、谷胱甘肽S转移酶（GST）、蛋白激酶C（PKC）等。本研究在使用单克隆抗体检测相关细胞中P-gp的表达时,发现肿瘤耐药细胞株Bats-72、Bads-200和MCF7/ADR中均表达一种分子量大于250 KDa的蛋白（M250）,药物敏感细胞BCap37则不表达M250。这提示M250与P-gp存在同源性,且可能与肿瘤耐药相关。本研究已成功分离得到M250,并计划进一步鉴定M250是否为一种新的肿瘤耐药标志物。氟维司群（Fulvestrant, ICI 182,780）是一种已用于临床治疗乳腺癌的新型选择性雌激素受体拮抗剂,能选择性降解雌激素受体从而阻断雌激素与受体结合。我们研究发现氟维司群可以逆转雌激素受体介导乳腺癌对紫杉醇和长春新碱类药物的耐药。新型耐药细胞株Bats-72和Bads-200均不表达ER-α。但是,氟维司群可以有效逆转Bats-72和Bads-200对紫杉醇介导的细胞毒性、细胞周期停滞和细胞凋亡的耐受,并呈剂量相关性。因此,我们证实了氟维司群不仅可以通过阻断ER-α介导的信号通路发挥化疗增敏作用,同时还存在不依赖于ER信号通路的耐药逆转作用。综上所述,本研究成功建立了乳腺癌耐药细胞株Bats-72和Bads-200;明确了Bats-72和Bads-200分别代表两种不同的耐药类型；揭示了ABC通道蛋白的表达差异在Bats-72和Bads-200的耐药特性中的核心作用；发现了潜在的肿瘤耐药相关蛋白——M250；证实了氟维司群不仅可以通过阻断ER-α介导的信号通路发挥化疗增敏作用,同时还存在不依赖于ER-α信号通路的耐药逆转作用。上述研究为系统地研究乳腺癌耐药提供具有科研价值的细胞模型,为进一步阐明肿瘤耐药机制提供了实验和理论补充,为临床有效逆转肿瘤耐药提供了潜在的新途径。