r-hCG的研制及其相关分子对肿瘤细胞体外生长的影响

论文摘要

人绒毛膜促性腺素（hCG）是由胎盘滋养层合体细胞分泌的一种异源二聚体糖蛋白激素,对维持孕妇的黄体功能、胎儿性别分化及防止母体对胎儿的排斥等方面具有重要生理功能,在临床治疗不孕症、黄体功能不足症等应用广泛。此外,hCG在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。本文对适宜高效表达hCG的载体系统、细胞上清中rhCG的纯化方法、hCG及其相关分子对多种肿瘤细胞体外生长的影响进行了研究。对常规重叠延伸PCR技术进行了改进,改进后的方法称之为一步法重叠延伸PCR,减少了进型PCR反应的次数,提高了效率。利用该方法,成功合成了hCGα、hCGβ及LHβ的全长cDNA。构建了pBudCE4.1-hCG、pcDNA3.1-IRES-hCG及pIRES-hCG三种双顺反子真核表达载体。三种载体表达效率比较证实,构建的pcDNA3.1-IRES-hCG载体可有效表达r-hCG, SDS-PAGE、Western Blot及N端氨基酸序列分析表明制备的r-hCG与天然hCG结构一致,小鼠子宫增重试验显示r-hCG具有激素活性。筛选获得了一批高表达hCG的重组细胞,其中表达水平最高的细胞株CHO-BF8可以达到14.4IU/106细胞·d。建立了细胞培养上清中r-hCG的纯化方法,经疏水层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析三步操作,制备的r-hCG纯度达到95%以上,其生物效价达到6941.2IU/mg。分析了hCG、hCGα、hCGβ、LHβ及hCGβ-CTP对肿瘤细胞的影响,结果表明hCG、hCGp-CTP对MCF-7、SK-BR3、BGC-823及LS-180细胞的体外增殖具有明显抑制作用,并呈剂量依赖性,但并未显示出直接杀伤效应。对Eca-109及NCI-H157影响不明显。hCGα、hCGβ及LHβ未表现出抑制肿瘤细胞增殖的作用。本项研究为利用CHO细胞大规模生产rhCG奠定了良好的基础,同时也为阐明hCG对肿瘤的作用提供了有益的参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 hCG双顺反子表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二章 r-hCG在CHO细胞中的表达、纯化及生物活性分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 hCG相关分子对肿瘤细胞体外生长的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 结论
• 对未来工作的展望
• 博士后在站期间发表的论文与著作
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 附录