论文摘要
引言类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种进展性自身免疫性疾病,主要累及关节,以滑膜增殖以及炎性细胞浸润为特征,最终导致组织破坏与残疾。滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLSs）在RA的发生、发展中发挥着重要作用,其与其他免疫炎性细胞共同作用,通过分泌基质金属蛋白酶（metalloproteinases, MMPs）到滑膜液中,并且直接迁徙至细胞外基质（extracellular matrix, ECM）中导致关节骨与软骨破坏。FLS侵袭正成为RA治疗的新靶点。MMPs与RA的发展密切相关,并且是FLS侵袭的重要因素。MMPs主要由促炎细胞因子活化Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）／核转录因子（nuclear factor-KB, NF-κB）等炎症信号通路,促进RA-FLS分泌。脂多糖（lipopo lysaccharide, LPS）是革兰氏阴性菌的细胞膜成分,研究发现其可促进肿瘤细胞的侵袭及转移。TLR4是LPS的受体,RA-FLS也固有表达TLR4。迄今,TLR4在RA-FLS侵袭中的作用及调控机制如何,尚无报道。南蛇藤素（celastrol,Cel）是从南蛇藤中提取的中药单体,既往对其研究多集中于抗肿瘤。中草药中的有效成分通常较传统抗RA西药具有更低的毒性和更好的药物耐受性,迄今,许多抗RA中草药的作用机制尚未完全明确。最近,研究报道南蛇藤素可抑制佐剂诱导性关节炎模型大鼠关节破坏。目前已知的南蛇藤素抗RA的机制包括抗炎、抑制免疫细胞浸润、抑制滑膜细胞增殖、免疫调节、抑制破骨细胞活化等。但是,南蛇藤素对RA-FLS侵袭的作用和具体机制如何,目前尚未阐明。在本研究中,我们观察南蛇藤素对LPS诱导的人RA-FLS迁徙与侵袭能力的影响；进一步探讨南蛇藤素抑制RA-FLS迁徙与侵袭的可能机制及作用靶点,并在体内水平探讨南蛇藤素对胶原诱导型关节炎大鼠（collagen-induced arthritis, CIA）滑膜炎症及关节破坏的影响及可能机制。研究内容共分为四部分：第一部分南蛇藤素对LPS诱导的RA-FLS侵袭的影响目的：为观察南蛇藤素（celastrol,Cel）对脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte, RA-FLS）迁徙与侵袭能力的影响。方法：从RA患者的滑膜体外分离培养FLSs,流式细胞术鉴定表面标志（CD14及CD68是巨噬细胞标记,CD90是成纤维细胞标记）。使用不同浓度的Cel处理RA-FLS24h, MTT法检测细胞活力。Transwell小室检测Cel对LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭能力的影响。结果：成功分离培养RA-FLS,利用流式细胞术,联合巨噬细胞表面标记（CD14和CD68）和成纤维细胞表面标记（CD90）进行鉴定RA-FLS。研究发现,第3代以后CD14及CD68表达率<1%,CD90表达率>98%,选取第3代-6代细胞进行实验。0.05μM到0.2μM的Cel作用24h及48h后对RA-FLS活力无明显影响。但是,较正常对照组相比,0.4μM与0.8μM的Cel可减少细胞活力约1倍与2倍。与正常对照组相比,LPS刺激24h,FLS迁徙能力可增加约3.05倍,与之相似,FLS侵袭能力可增加约7.02倍。Cel可呈浓度依赖性的抑制LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭。结论：这些结果表明非细胞毒浓度的Cel （0.05μM～0.2μM）可以抑制LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭,Cel可能通过抑制LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭达到抗RA的治疗作用。第二部分南蛇藤素抑制MMP-9介导的RA-FLS侵袭的研究目的：为探讨Cel是否通过抑制基质金属蛋白酶（metalloproteinases, MMPs）活性达到抗LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭作用。方法：利用荧光实时定量PCR（quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR）及Western Blot检测不同浓度的Cel （0.05μM,0.1μM,0.2μM）对LPS刺激下RA-FLS上相关MMPs表达的影响；收集细胞上清,使用酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）及明胶酶谱方法分析Cel对LPS刺激下RA-FLS上MMP-9的分泌水平及酶活性的影响；进一步利用利用小RNA干扰RNA （small intefere RNA, siRNA）抑制MMP-9的表达,以验证其在介导RA-FLS迁徙与侵袭中的作用。结果：当使用不同浓度的Cel （0.05μM,0.1μM,0.2μM）预处理RA-FLS24h,再予1μg/mL的LPS刺激,发现MMP-1、2、3的表达无明显改变,而MMP-9的表达水平显著下降；在非细胞毒浓度范围内,Cel可呈浓度依赖性的抑制LPS诱导的MMP-9mRNA的表达水平。ELISA（?）口明胶酶谱结果显示1μg/mL的LPS作用RA-FLS24h可增加MMP-2及MMP-9的酶活性水平,其中MMP-9增加最为显著；而当使用不同浓度的Cel(0.05μM,0.1μM,0.2预处理RA-FLS24h,再予1μg/mL的LPS刺激,发现对MMP-2的酶活性水平无影响,而0.05μM-0.2μM的Cel可显著下调MMP-9的酶活性水平。在非细胞毒浓度范围内,Cel可呈浓度依赖性的抑制LPS诱导的MMP-9酶活性水平。瞬时转染MMP-9siRNA到RA-FLS后,可显著抑制1μg/mL的LPS诱导RA-FLS的迁徙与侵袭的细胞数量,与siRNA对照组相比,迁徙与侵袭能力下降了约70%。结论：这些结果表明,Cel可以选择性的抑制LPS诱导的MMP-9的基因、蛋白、酶活性水平,并且证实了MMP-9在LPS诱导的RA-FLS迁徙与侵袭中作用。第三部分南蛇藤素抑制TLR4/NF-KB通路活化下调MMP-9转录的研究目的：为阐明Cel抑制Toll样受体4（Toll-like receptor4, TLR4）／核转录因子（nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路活化进而抑制MMP-9转录的机制。方法：我们分别构建MMP-9启动子上NF-κB及AP-1位点突变的荧光素酶报告基因质粒,予不同浓度的Cel（0.05μM,0.1μM,0.2μM）作用24h后,利用双荧光素酶报告基因分析Cel对转录因子NF-κB及AP-1与MMP-9启动子结合活性的影响,证实Cel通过抑制NF-κB与MMP-9启动子结合下调MMP-9转录活性；凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay, EMS A）体外研究Cel对NF-κB与MMP-9启动子NF-κB位点结合的影响；染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）进一步体内验证Cel对NF-κB与MMP-9启动子NF-κB位点结合的作用；并检测了不同浓度Cel对TLR4/NF-κB信号通路主要转导分子TLR4、髓样分化蛋白88（myeloid differentiation primary response gene88, MyD88）、包含TIR域的IFN-β诱导转接蛋白（TIR domain containing adaptor inducing interferon β, TRIF）、核转录因子-κB抑制因子（inhibitor of nuclear factor-κB,IκBα）表达的影响；同时分别加入TLR4通路抑制剂TAK-242及TLR4中和抗体,观察对MMP-9表达的影响。结果：不同浓度的Cel可以抑制包含AP-1位点突变的MMP-9启动子的相对荧光素活性,而对包含NF-κB位点突变的MMP-9启动子的相对荧光素活性无明显影响。EMSA体外研究发现LPS刺激RA-FLS后,NF-κB与MMP-9启动子结合活性升高,当予不同浓度的Cel处理后,再予LPS刺激,NF-κB与MMP-9启动子结合活性较前下降；ChIP体内研究也证实LPS刺激后,NF-κB与MMP-9启动子结合活性升高,而当予不同浓度的Cel作用后,NF-κB与MMP-9启动子结合活性较前下降。LPS刺激后明显促进了IκBα蛋白磷酸化以及IκBα的降解,并且明显抑制了LPS诱导的TLR4与MyD88蛋白的表达上调,Cel对TRIF的蛋白表达无显著影响；qRT-PCR结果发现TLR4信号通路阻断剂TAK-242及TLR4中和抗体均可明显的下调MMP-9mRNA、蛋白表达水平及MMP-9的酶活性水平,并且双荧光素酶报告基因分析也显示,抑制TLR4通路或TLR4的表达,可显著下调LPS诱导的MMP-9的转录活性结论：这些结果提示Cel通过抑制TLR4/MyD88/NF-KB通路活化,下调LPS诱导的RA-FLS中MMP-9的表达。第四部分南蛇藤素抑制CIA大鼠滑膜炎症及关节破坏的研究目的：为从整体水平探讨Cel治疗类风湿关节炎的作用与机制。方法：建立胶原诱导型关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠模型,Cel（0.5mg/kg与1mg/kg）从第21天开始每天腹腔注射一次,MTX (2mg/kg从第21天开始每周腹腔注射一次；使用关节炎指数（arthritis index, AI）评估关节炎严重程度,从初次免疫后20天～40天期间,每3天观察1次。第42天,使用齿科X-线机进行右后足关节拍片评估关节破坏程度。然后,处死大鼠,解剖分离右侧膝关节滑膜切片用于组织病理学分析。滑膜切片H&E染色后对滑膜增殖程度及炎性细胞浸润程度进行评分。并且,收集各组大鼠血清,采用Western blot方法检测MMP-2与MMP-9的活性水平。结果：我们在造模第18-21天评估造模效果。各药物治疗组较模型对照组软组织肿胀均有不同程度的改善,高剂量Cel （1mg/kg）组较低剂量Cel （0.5mg/kg）组关节破坏程度轻,且高剂量Cel治疗组以及MTX治疗组关节间隙正常。不同浓度Cel治疗组的AI评分从造模第26天开始与CIA对照组显著下降,高剂量Cel组AI较低剂量Cel治疗组AI下降更为显著,且高剂量Cel组AI下降与MTX治疗组无显著性差异。与CIA对照组相比,Cel治疗组可明显减轻滑膜增生及炎性细胞浸润程度,1mg/kg的Cel高剂量组较0.5mg/kg的Cel低剂量组可以更有效的抑制CIA大鼠滑膜增生及炎性细胞浸润,高剂量组的疗效与MTX（2mg/kg）组类似。Western blot结果发现Cel治疗组可呈浓度依赖性的降低CIA大鼠血清MMP-9的表达水平,而对CIA大鼠血清MMP-2表达水平无显著抑制作用。结论：这些结果表明Cel可通过下调MMP-9的活性抑制CIA大鼠的滑膜炎症与关节破坏。
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