沉默Survivin基因对大肠癌HCT-8/VCR耐药细胞凋亡及药物敏感性影响的初步研究

论文摘要

目的/背景大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,近年,随着社会经济的发展,生活方式和饮食习惯的改变,我国大肠癌发病率呈上升趋势,其发病率仅次于胃癌、食管癌,居4-6位。在治疗上,虽然现代外科手术方法取得了一定进展,但是对术后复发或转移尚缺乏有效手段。近年来,化疗作为大肠癌患者围手术期治疗已取得了显著疗效,但是,由于耐药的发生,常常导致大肠癌化疗的失败,肿瘤细胞耐药性限制了疗效的提高。肿瘤耐药和细胞凋亡是目前肿瘤研究的两个热点,传统的肿瘤治疗观念是化疗药物直接作用于核酸、微管蛋白和其他靶点杀伤肿瘤细胞,随着细胞凋亡研究的逐步深入,人们认识到化疗药物也可以通过诱导细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞,因此对肿瘤细胞凋亡的抑制,可导致对多种化疗药物产生耐药性。现己知通过凋亡发挥抗肿瘤效应的化疗药物有顺铂、紫杉醇、依托泊甙、氟尿嘧啶、长春新碱等。许多基因及调控因子参与化疗药物诱导的细胞凋亡过程,表现出与化疗耐药相关。大肠癌耐药机制涉及多方面,目前认为,细胞对药物诱导凋亡的耐受或凋亡阈值的增高,是大肠癌耐药的主要机制之一。如何调控异常的凋亡途径,恢复肿瘤对化疗药物等刺激因子诱导的凋亡敏感性,成为肿瘤耐药研究的重要课题。基因治疗是逆转肿瘤耐药的重要策略之一。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成员,具有3个主要特点:1、Survivin基因是迄今发现最强的凋亡抑制因子。2、在有丝分裂的开始,Survivin维护有丝分裂的正常进行,从而促进细胞增殖3、Survivin参与毛细血管网的形成,抑制血管内皮细胞凋亡,促进血管生成。Survivin mRNA和蛋白几乎在所有被研究的肿瘤细胞中过度表达,如肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肾肿瘤及黑色素瘤等,在恶性肿瘤的发生发展以及化疗耐药中起重要作用。Thomberry和Lazebnik的实验证实,caspase活化的凋亡通路与化疗药物敏感性有密切关系,凋亡抑制基因表达上调或凋亡促进基因表达下调所导致的凋亡反应性降低是肿瘤细胞耐药的原因之一。另有实验证明下调Survivin的表达可增强非小细胞肺癌细胞H520对顺铂的化疗敏感性。Survivin主要通过3种方式直接或间接抑制caspases活性而发挥抗凋亡作用:1、Survivin以同源二聚体的形式与终末效应器Caspases-3、Caspases-7形成稳定的结合,从而抑制二者的蛋白切割作用,阻断来自Fas/FasL通路和（或）线粒体通路的凋亡信号,阻断肿瘤细胞凋亡。2、以SMAC作为中介与Caspases-9结合抑制其活性3、与细胞周期蛋白激酶cdk4、p34cdc2相互作用,使p21从CDK4的复合体释放出来,p21进一步与线粒体caspase-3结合,抑制其活性,使细胞凋亡受到抑制。RNA干扰（RNA interfering,RNAi）技术为近年基因表达调控的研究热点,它将与目的基因mRNA序列互补的小分子干扰核糖核酸（small interferenceRNA,siRNA）或短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）导入靶细胞,通过序列互补配对法则特异性降解目的基因,抑制序列特异性的基因表达。RNAi可以沉默癌基因、促进凋亡、调控细胞周期、抗血管生成。近年研究表明利用RNAi技术是Survivin基因沉默的有力手段,且其作用强大、迅速。本课题组的前期研究发现,应用RNAi技术阻断结肠癌细胞（Lovo）中Survivin表达可显著抑制其生长。本研究通过浓度递增诱导法建立大肠癌HCT-8/VCR耐药细胞株,应用RNAi技术靶向干扰大肠癌耐药细胞株Survivin基因,观察沉默Survivin基因后耐药细胞耐药性是否会有影响,会有什么影响?Survivin基因在耐药细胞株凋亡机制上有何作用?从而进一步发现Survivin基因在耐药发生、发展中的作用,为大肠癌的耐药治疗提供新的线索。方法一、大肠癌HCT-8/VCR耐药细胞的建立。1、以长春新碱（VCR）为诱导药物,HCT-8细胞株为研究对象,利用浓度递增诱导法建立HCT-8/VCR耐药细胞系。2、半效抑制浓度（IC50）测定取对数生长期的HCT-8和HCT-8/VCR采用CCK-8法。应用酶标仪以450为波长,测定样品的吸光度（OD）值,并计算抑制率。抑制率=（1-OD药物/OD对照）×100%,半对数纸上绘制剂量效应曲线,确定IC50。3、耐药指数测定耐药指数=耐药细胞IC50/正常细胞IC50。4、生长曲线测定对数生长期HCT-8和HCT-8/VCR细胞消化后移入离心管,配制成105/ml细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔3ml,每24h记数3孔,共记数7d,取其均值,绘制细胞增殖曲线。按下列公式计算细胞对数增殖期的Td（h）=（Tlg2）/（lgN-lgN0）。其中T为细胞处于对数增殖的时间,No为对数增殖起始的细胞数,N为对数增殖结束的细胞数。二、RNA干扰沉默HCT-8/VCR细胞中Survivin基因,检测基因表达、细胞凋亡及细胞对药物敏感性情况。将HCT-8/VCR细胞分为以下各组进行实验:A:单独干扰组B:干扰+药物组（联合组）C:单独药物组D:阴性对照组。采用脂质体转染技术将SurvivinsiRNA转染入大肠癌HCT-8/VCR细胞,培养48小时后通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Survivin mRNA表达;通过蛋白质印迹法（Western blot）检测Survivin蛋白表达;通过Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态学变化;通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞分析各组细胞凋亡率;通过Caspase-3检测试剂盒检测各组Caspase-3活性;耐药细胞对药物敏感性实验:通过cck-8法检测RNA干扰前后HCT-8/VCR细胞对VCR的IC50值。结果1、经过8个月的诱导培养,HCT-8细胞可在含3.0μg/mL的VCR培养液中稳定生长增殖。细胞命名为HCT-8/VCR。IC50（HCT-8）:1.11±0.11μg/mL,IC50（HCT-8/VCR）:13.46±0.72μg/mL,p＜0.05。耐药指数（RI）:12.17.2、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测法检测,结果显示RNA干扰48h后,HCT-8/VCR细胞Survivin mRNA表达降低（F=958.837,P＜0.05）;蛋白质印迹法（Wstern blot）检测表达,结果示转染48 h后,Survivin蛋白表达降低（F=958.470,P＜0.05）:Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态学变化,结果表明干扰组HCT-8/VCR细胞呈现明显细胞核固缩或分叶、碎裂状等凋亡形态学特征,而对照组很少或无;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞分析,VCR两水平间细胞凋亡率有显著差异（F=1516.185,P＜0.05）、Survivin siRNA两水平间细胞凋亡率有显著差异（F=2190.548,P＜0.05）,且Survivin siRNA与VCR联合交互效应显著（F=467.371,P＜0.05）;Caspase-3检测试剂盒测定波长为405nm检测各组Caspase-3活性。Caspase-3的活性比Survivin siRNA+VCR组、VCR两水平间细胞凋亡率有显著差异（F=193.624,P＜0.05）、Survivin siRNA两水平间细胞凋亡率有显著差异（F=68.175,P＜0.05）,且Survivin siRNA与VCR联合交互效应显著（F=10.107,P＜0.05）。cck-8法检测HCT-8/VCR细胞和Survivin siRNA干扰后HCT-8/VCR细胞对VCR的敏感性（IC50）（x±s）分别为12.96±0.57μg/ml和6.95±0.28μg/ml,耐药细胞对药物敏感性提高（P＜0.05）。结论1、HCT-8细胞可在含3.0μg/mL的VCR培养液中稳定生长增殖。2、Survivin siRNA成功下调Survivin的表达,可能通过解除对Caspase-3的活性抑制诱导了自身细胞凋亡,并逆转细胞对VCR诱导的细胞凋亡的耐受,降低凋亡阈值,从而增强了大肠癌耐药细胞对VCR的敏感性;Survivin siRNA与中低剂量VCR联用引起细胞凋亡具有协同作用。将靶向Survivin基因的siRNA作为大肠癌临床辅助治疗有光明的前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 中英文缩写对照表
• 攻读学位期间发表论文
• 致谢
• 统计学证明