基于PCR-DGGE方法的转Nib8基因小麦根际土壤细菌群落多样性分析

论文摘要

根际土壤微生物是作物生态系中重要的参与者。根际土壤微生物的生态变化,会影响到植物病原微生物的消长,最终影响重大植物病害的灾变。因此,对根际土壤微生物生态的影响是转基因作物尤其是抗土传病害的转基因作物环境安全评价的重点之一。本试验以转Nib8基因抗小麦黄花叶病毒病的小麦根际土壤为研究对象（土壤样品采自江苏六合、河南新乡、扬州里下河转基因试验田及江苏南京温室盆栽）,优化了传统土壤微生物总DNA提取方法、DGGE电泳条件和方法。对土壤中细菌16SrDNA V3可变区PCR扩增产物进行DGGE电泳,用Quantity One对电泳结果进行分析,分析结果明确了细菌群落遗传多样性变化情况,从而对此种转基因小麦的环境安全性做出评估,为长期监测转基因作物对土壤微生物菌群变化的影响提供可靠的实验方法。通过对四种不同土壤微生物总DNA提取方法的比较,SDS高盐法适合河南地区土壤微生物总DNA的提取,对六合、扬州和盆栽的土壤的适应性不强；变性剂加SDS方法适合于六合地区土壤微生物总DNA的提取,对其余地区土壤的适应性不强；冻融-溶菌酶裂解法只对六合和盆栽试验土壤具有较强的适应性,对另外两个地区的土壤适应性不强；酚氯仿/异戊醇抽提法对四个地区土壤提取出的DNA片段的吸光值均大于1.7,表明所提取的DNA片段完整、量足够,说明此方法对不同的土壤均具有较强的适应性,此种微生物总DNA提取方法为后续的分子生物学试验的顺利进行奠定基础。垂直电泳法确定最佳变性剂浓度梯度范围试验,结果表明：DNA在低变性剂浓度（0%～40%）时未解链,整个过程都是以双链的形式进行迁移；变性剂浓度在40%～80%之间时,部分DNA出现了不同程度的解链,电泳过程中停留在凝胶的相应位置上；当变性剂浓度达到80%以上时,所有的DNA全部解链,解链后都停留在电泳起初的位置,即凝胶的最顶部。从以上结果可以看出该试验样品电泳的可用变性剂梯度范围为40%～80%,根据上图中曲线部分斜率变化情况可知,变性剂浓度在50%～65%之间是最佳的变性剂范围。时间间歇法确定最佳电泳时间试验,结果表明：电泳的最佳时间为12小时,在12小时处电泳条带分离的效果最好,并且样品已达到凝胶的底部,再增加电泳时间对条带的分离没有实际的用处。分析江苏六合丘陵地区、扬州里下河地区、河南新乡及江苏南京温室土壤DGGE电泳图谱,结果表明：在小麦播种前,转基因试验田块与受体品种试验田决的土壤细菌种类和数量几乎相同；苗期阶段,转基因品种和受体品种之间的差异性不明显,主要表现在高度相似的泳道波形曲线上；在小麦的返青期至扬花期之间,转基因品种对其根际土壤细菌群落多样性产生了影响,使小麦根际细菌的丰度提高、数量增加；灌浆期至成熟期之间,转基因品种与其受体品种之间的变化趋于不明显。值得指出的是,小麦黄花叶病毒病是由土传的禾谷多粘菌作为传毒媒介,发病期为小麦返青期。小麦根际细菌数量增加,是转基因小麦抗病所衍生的结果,还是导致转基因小麦抗病的原因,值得进一步研究。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 转基因作物的发展
• 1.1 基因工程的发展
• 1.2 转基因作物的类型
• 1.3 基因工程在粮食作物上的应用
• 1.4 基因工程在经济作物上的应用
• 2 转基因作物对经济社会的贡献
• 3 转基因作物可能存在的风险
• 3.1 转基因作物有可能破坏自然生态系统
• 3.2 转基因作物有可能对非靶标生物尤其有益生物产生危害
• 3.3 转基因作物本身可能演变为农田杂草
• 3.4 基因漂移对近缘物种的影响
• 3.5 转基因作物可能对环境微生物的多样性产生影响
• 4 转基因作物的安全评价
• 4.1 转基因作物安全评价的必要性
• 4.2 微生物群落结构研究方法
• 4.2.1 传统可培养技术
• 4.2.2 生物标记法
• 4.2.3 分子生物学方法
• 5 PCR方法简介
• 5.1 PCR技术的基本原理
• 5.2 不同策略的PCR技术简介
• 5.2.1 锚定PCR（anchored PCR）
• 5.2.2 不对称PCR（asymmetric PCR）
• 5.2.3 反向PCR（inverse PCR）
• 5.2.4 逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）
• 5.2.5. 荧光定量PCR（Q-PCR）
• 6 本研究的意义、研究目标与研究内容
• 6.1 研究意义
• 6.2 研究目标
• 6.3 研究内容
• 第二章 小麦根际土壤细菌DNA提取方法的选择与优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 土壤采集的经纬度
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.1.4 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 土壤样品采集点的确定方案
• 1.2.2 采集点的确定
• 1.2.3 土壤样品的预处理
• 1.2.4 小麦根际土壤微生物总DNA的提取
• 1.2.5 DNA质量测定
• 1.2.6 DNA纯度测定
• 1.2.7 不同提取方法对后期实验适应性分析
• 2 结果
• 2.1 不同提取方法对DNA粗提取产物质量的影响
• 2.2 不同提取方法对DNA粗提物纯度的影响
• 2.3 不同提取方法对后期实验适应性分析结果
• 3 讨论
• 第三章 PCR-DGGE对小麦根际细菌群落多样性的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 主要溶液
• 1.3 方法
• 1.3.1 PCR条件的优化
• 1.3.2 DGGE条件的选择和优化
• 1.3.3 凝胶的制备
• 1.3.4 银染步骤
• 1.3.5 Quantity one软件分析DGGE结果
• 1.3.6 DGGE条带的克隆
• 1.3.7 序列测定和系统发育分析
• 2 结果
• 2.1 DGGE变性剂梯度选择的结果
• 2.2 DGGE电泳最佳时间的选择结果
• 2.3 六合转基因试验田小麦各生长期细菌群落变化分析DGGE图谱
• 2.4 河南新乡转基因试验田小麦各生长期细菌群落变化分析DGGE图
• 2.5 扬州农科所转基因试验田小麦各生长期微生物菌群变化分析
• 2.6 扬州农科所转基因试验田小麦各生长期微生物菌群变化分析
• 2.7 DGGE条带的克隆测序结果
• 2.8 DGGE条带同源性比较结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文目录
• 致谢