论文摘要
随着人类基因组计划和其它模式植物如拟南芥、水稻等基因组计划的完成以及人们对基因认识的不断深入,植物基因组研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究。因此进入后基因组时代,运用与发展分析基因功能的反向遗传学的方法和技术已日渐成为生物研究领域的热点。高盐环境是影响植物的生长和发育的主要环境因子之一。土壤盐分过高还可造成盐碱地,限制土壤的利用。目前,世界耕种土地的大约20%和接近一半的灌溉土地都遭到了盐胁迫的危害。过高的Na+浓度引起的离子毒害、渗透胁迫和K+/Na+比率的不平衡,使植物新陈代谢异常,这是盐胁迫对大多数植物造成伤害的原因。因此,无论盐生植物还是甜土植物,植物响应盐胁迫的最终结果就是降低胞质内的Na+浓度和维持胞质内的K+、Na+平衡。随着分子遗传学和植物转基因技术的发展,采用生物技术提高作物的耐盐性,使作物在盐胁迫环境中能正常生长并提高作物的产量,正受到越来越多的关注并取得了一定的成果。NHX1是液泡膜中的一种Na+/H+逆向转运蛋白,可促进钠离子在液泡中的区隔化效应,跨液泡膜的pH为其提供能量。钠离子和氯离子区隔化在液泡中,不仅可作为有效的渗透调节剂,还可减小细胞毒性,从而提高植物的耐盐能力。研究表明在拟南芥、油菜、番茄、水稻及棉花中超表达液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白都能够有效提高转基因植物的耐盐性。基于本实验室克隆的灰绿藜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因CgNHX1的cDNA序列（AY371319）,本研究通过对拟南芥的遗传转化证明该基因在拟南芥中的过量表达提高了转基因植株的耐盐能力。同时对灰绿藜CgNHX1和水稻OsNHX1基因（AB 021878）C端序列进行分析,构建C端缺失重组表达载体后农杆菌法转化拟南芥,分别获得了超表达CgNHX1-histag、OsNHX1-histag、dcCgNHX1-histag、dcOsNHX1-histag的转基因植株,为研究盐生植物和甜土植物NHX1基因C端的调控差异奠定了基础。另外,为研究灰绿藜CgNHX1和CgVP1蛋白的亚细胞定位成功构建了pCAMBIA1301-1-CgNHX1-GFP和pCAMBIA1301-1-CgVP1-GFP的融合表达载体,并初步将CgNHX1蛋白初步定位于膜系统上。首先,以盐生植物灰绿藜cDNA为模板进行PCR扩增,获得完整的CgNHX1 cDNA序列。利用携带该基因的双元表达载体pCAMBIA1301-1-CgNHX1,采用根癌农杆菌浸染法转化拟南芥并经潮霉素筛选、获得了T2代纯合子转基因植株。PCR和RT-PCR检测结果表明CgNHX1整合于转基因拟南芥的基因组中,并在转录水平有表达。在50mM NaCl和100mM NaCl胁迫下,转基因植株和野生型植株地上部的Na+含量均显著增加,转基因植株的Na+含量略高于野生型植株的Na+含量,但并没有达到显著性差异。然而在150mM NaCl胁迫下,转基因植株比野生型植株的耐盐性显著提高,根系更发达,且转基因植株的Na+含量低于野生型植株的Na+含量。研究结果表明,CgNHX1的过量表达能够提高转基因拟南芥的耐盐能力。研究表明拟南芥AtNHX1蛋白的C端具有能选择调节逆向转运蛋白阳离子转运的功能。为比较盐生植物与甜土植物NHX1基因C端调控区的功能差异,本文通过PCR的方法缺失灰绿藜CgNHX1与水稻OsNHX1蛋白C末端约100个氨基酸的亲水区序列,并将带有6个组氨酸标签的缺失C端的基因与完整的基因经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后同时构建到植物表达载体pCAMBIA1301-1上,转化根癌农杆菌后采用花序浸染法转化拟南芥,初步筛选分别获得了超表达CgNHX1-histag、OsNHX1-histag、dcCgNHX1-histag和dcOsNHX1-histag的T1代转基因植株。经PCR验证CgNHX1-histag和OsNHX1-histag已整合于转基因植物的基因组中。另外,实验过程中还对本实验室拟南芥的栽培和转化条件进行了初步的摸索。蛋白质在细胞器中的定位对于明确其功能和参与代谢途径起着非常重要的作用。用PCR的方法从pCAMBIA1302载体上扩增得到了长度为756bp的GFP序列,经SalⅠ和PstⅠ双酶切后克隆入植物表达载体pCAMBIA1301-1,获得重组质粒pCAMBIA1301-1-GFP。根据本实验室克隆的灰绿藜CgNHX1和CgVP1（DQ443731）的cDNA序列设计特异性引物扩增获得完整的去除终止密码子的CgNHX1和CgVP1基因,回收产物分别经过BamHⅠ和SalⅠ或KpnⅠ和SalⅠ双酶切后连接到pCAMBIA1301-1-GFP载体上,酶切和PCR鉴定表明成功构建了pCAMBIA1301-1-CgNHX1-GFP和pCAMBIA1301-1-CgVP1-GFP融合表达载体。测序结果也表明两个融合的基因在同一个读码框内。瞬时表达的检测结果表明CgNHX1蛋白可能位于膜系统上。