HCV 1b型全基因组转基因小鼠模型的建立与特性鉴定

论文摘要

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的重要原因之一。全球范围内约有2亿人血清呈HCV阳性,其感染率约占全球人口的2～3%,我国丙型肝炎的患病率达3.2%。HCV是单股正链RNA病毒,其基因组大小为9.6kb,包括一个大的开放阅读框（ORF）和两侧的5’、3’非编码区（NTRs）。由于HCV感染具有严格的种属特异性,目前除了人和黑猩猩易感外,尚没有理想的丙型肝炎感染的实验动物模型。由于HCV的高变异性以及缺乏高效率的细胞培养体系和合适的HCV感染小动物模型,严重阻碍了科学家对HCV生活史、疫苗和其特异性抗病毒药物的研究。为解决上述难题,本研究通过分子克隆的方法构建了两个重组质粒pIRESneo-HCV、pLNCX-HCV,两个重组质粒在真核细胞上得到了有效表达。通过两种方式构建了转基因小鼠:（1）将重组质粒pIRESneo-HCV线性化后,通过显微注射的方式构建HCV全基因组的转基因小鼠;（2）采用逆转录病毒载体介导的方式构建HCV全基因组的转基因小鼠。结果共获得7只F0代（3只为死胎）的转基因阳性小鼠,F0代小鼠与正常小鼠交配后共繁育27只F1代转基因小鼠,其中9只呈HCV阳性。随机抽取3只F1代转基因阳性小鼠进行了RT-PCR、血清酶类测定、免疫组化及Western-bloting分析。RT-PCR检测结果显示小鼠的肝脏中有外源基因mRNA的表达;免疫组化检测结果表明了有HCV病毒蛋白的表达;ALT和AST测定结果表明了转基因阳性小鼠的肝细胞有不同程度的损伤;Western-bloting分析显示不但有HCV结构蛋白E2和core的表达,而且还有非结构蛋白NS5的表达;对小鼠两个世代观察发现:它们在外形、生长速度及繁育方面与正常小鼠无差异,表明HCV全基因组的导入对转基因小鼠的生长发育无明显影响。本研究结果为HCV全基因组转基因小鼠模型的进一步研究及对HCV致病机理、疫苗研究和抗病毒药物的筛选奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 丙型肝炎病毒基因组及其蛋白的分子生物学研究进展
• 1.1 HCV 基因分型及分布
• 1.2 HCV 基因型与临床表现的关系
• 1.3 HCV 基因组的结构
• 1.4 HCV 基因组的复制
• 1.5 小结
• 第2章 转基因动物模型的研究进展
• 2.1 转基因动物的研究概况
• 2.2 转基因动物构建的一般方法
• 2.3 转基因动物应用
• 2.4 转基因动物存在的问题
• 第3章 慢病毒载体研究进展
• 3.1 慢病毒基因组结构及特点[128]
• 3.2 慢病毒载体
• 3.3 慢病毒载体的应用
• 3.4 慢病毒载体的运用前景及展望
• 第二篇 实验内容
• 第1章 丙型肝炎病毒18型全基因组重组质粒的构建及其感染细胞系的建立
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 第2章 HCV 全基因组转基因小鼠模型的制备
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第3章 HCV 全基因组F1 代转基因小鼠表达分析
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 博士期间已发表的论文及待发表的论文
• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 导师简介
• 作者简介