滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠Wnt信号传导的影响

论文摘要

目的通过体内实验和体外实验,从对成骨细胞具有重要调控作用的Wnt信号通路传导的角度,揭示滋阴补肾法治疗糖皮质激素性骨质疏松症的作用机理,并为阐明中医“肾主骨”机理的科学内涵提供进一步的实验依据。方法1体内实验将55只雌性Wistar大鼠随机分为4组:正常对照组12只、模型组15只、阳性对照组13只、滋补肾阴组15只。模型组大鼠肌注地塞米松0.1ml/100g体重,给药浓度为1mg/ml,给药剂量为1mg/kg体重,每周2次,连续8w;正常对照组则相应肌注等体积的生理盐水。阳性对照组及滋补肾阴组除按以上方法肌注地塞米松外,阳性对照组灌胃给予阿法骨化醇1ml/100g体重,给药浓度为0.005μg/ml,给药剂量为0.05μg/kg体重;滋补肾阴组灌胃给予左归丸水煎剂1ml/100g体重,给药浓度为0.952g生药/ml,给药剂量为9.52g生药/kg体重,以上给药每天1次,每周6天,连续8w。各组大鼠于处死前16天和前3天分别腹腔注射盐酸四环素30mg/kg体重,以对骨进行荧光标记。给药结束后,采用大鼠麻醉后股动脉取血法,所取全血静置1h后,经2000rmp离心10 min后取血清,采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清中BGP、E2、PTH、IGF-Ⅰ的水平。取血后将各组大鼠处死,取右侧胫骨近端1/3,制作不脱钙骨切片,采用骨组织形态计量学方法,检测各组大鼠胫骨骨小梁体积百分比（TBV%）、骨小梁吸收表面百分比（TRS%）、骨小梁形成表面百分比（TFS%）、骨小梁矿化率（MAR）、类皮质平均宽度（OSW）、骨皮质矿化率（mAR）,以观察各组大鼠骨形成及骨吸收等骨代谢情况。取左侧胫骨近端1/3,制作大鼠胫骨脱钙骨的冰冻切片,分别采用免疫组化、原位杂交法检测各组大鼠胫骨成骨细胞及骨髓基质细胞中Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白及mRNA的表达。2体外实验2.1左归丸含药血清的制备雌性Wistar大鼠20只,随机分为2组:正常对照组和左归丸治疗组,每组10只。左归丸治疗组大鼠:地塞米松0.1mg/100g肌注,每周2次,连续8w,然后灌服左归丸,一日2次,连续5次,于末次给药1h,乙醚麻醉,无菌条件下,经腹主动脉采血,冷置1h后,离心（2500r/min,25min）,分离血清,是为左归丸含药血清,56℃灭活30min,-20℃冰箱保存备用。正常对照组按以上程序,灌服等容积的蒸馏水,所取血清即正常对照组血清。2.2 MTT法测定不同实验条件对成骨细胞增殖的影响本实验分为6组:成骨细胞（OB）+正常血清组,OB+10-7mol/L地塞米松组,OB+10-8mol/L地塞米松组,OB+5%左归丸含药血清组、OB+10%左归丸含药血清组、OB+15%左归丸含药血清组,每组8个样本。将成骨细胞悬液浓度调节至为1×104/ml,将其接种至96孔细胞培养板,每孔200μl,培养12h细胞贴壁后,分别用正常对照组血清、10-7mol/L地塞米松、10-8mol/L地塞米松、5%左归丸含药血清、10%左归丸含药血清、15%左归丸含药血清处理各组细胞,5%CO2,37℃,继续培养96h,然后用MTT法于酶标仪上检测波长为570nm处各种细胞的OD值。2.3左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP-6、β-catenin蛋白及mRNA表达的影响本实验分为3组:正常血清组,地塞米松组,左归丸含药血清组。培养12h后,分别用正常对照组血清、10-7mol/L地塞米松、15%左归丸含药血清处理各组细胞,继续培养96h。随后分别采用免疫印迹法及荧光实时定量PCR（Realtime PCR）技术检测各组细胞中Wnt3α、LRP-6、β-catenin蛋白及mRNA的表达。3统计学分析以上实验结果皆以均数±标准差（（?）±s）表示,采用单因素方差分析（ANOVA）进行数据处理,组问两两比较,采用q检验。结果1体内实验1.1滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响1.1.1滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨TBV%的影响模型组大鼠胫骨TBV%显著低于正常对照组。阳性对照组及滋补肾阴组的TBV%均显著高于模型组,但与正常对照组相比仍有显著差异;与阳性对照组比较,滋补肾阴组的TBV%显著降低。见表1。注:与正常对照组比较:*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05,△△P<0.01;与阳性对照组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01;下同。1.1.2滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨TRS%的影响与正常对照组比较,模型组大鼠胫骨TRS%显著增高。阳性对照组的TRS%明显高于正常对照组,但显著低于模型组。滋补肾阴组的TRS%与正常对照组及阳性对照组相比,显著增高;与模型组相比,没有差异,但有明显的降低趋势。见表2。1.1.3滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨TFS%和MAR的影响模型组大鼠胫骨TFS%和MAR较正常对照组皆显著降低。与模型组相比,阳性对照组的TFS%和MAR皆显著增高,而与正常对照组相比,TFS%仍显著降低,MAR则无显著差异。滋补肾阴组与模型组相比,TFS%和MAR均显著增高,与阳性对照组相比,无显著性差异;但与正常对照组相比,仍明显降低。见表3。1.1.4滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨mAR和OSW的影响模型组大鼠胫骨mAR和OSW显著低于正常对照组。阳性对照组及滋补肾阴组的mAR和OSW与模型组相比皆显著增高,但比正常对照组仍显著降低。与阳性对照组相比,滋补肾阴组的mAR和OSW无显著性差异。见表4。1.2滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨OB及MSC Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白和mRNA表达的影响1.2.1滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨OB及MSC Wnt1蛋白和mRNA表达的影响模型组大鼠胫骨OB及MSC的Wnt1蛋白和mRNA表达阳性密度较正常对照组皆显著降低。阳性对照组及滋补肾阴组OB、MSC的Wnt1蛋白和mRNA表达阳性密度皆显著高于模型组;但与正常对照组相比,仍显著降低。滋补肾阴组OB及MSC Wnt1蛋白表达的阳性密度与阳性对照组相比,明显降低。见表5。1.2.2滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨OB及MSC LRP-5蛋白和LRP mRNA表达的影响与正常对照组相比,模型组大鼠胫骨OB及MSC的LRP-5蛋白和LRP mRNA表达阳性密度皆显著降低。阳性对照组及滋补肾阴组OB及MSC的LRP-5蛋白和LRP mRNA表达阳性密度皆显著高于模型组;但与正常对照组相比,仍显著降低。与阳性对照组相比,滋补肾阴组LRP-5蛋白和LRP mRNA表达的阳性密度显著降低。见表6。1.2.3滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨OB及MSCβ-catenin蛋白和mRNA表达的影响与正常对照组相比,模型组大鼠胫骨OB及MSC的β-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度皆显著降低。阳性对照组OB及MSC的β-catenin蛋白和mRNA表达阳性密度皆显著高于模型组;但与正常对照组相比,仍显著降低。滋补肾阴组OB及MSCβ-catenin蛋白和mRNA表达的阳性密度与模型组相比,明显增高,但显著低于正常对照组;且与阳性对照组相比,β-catenin蛋白表达的阳性密度明显降低。见表7。1.3滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中BGP、E2、PTH、IGF-Ⅰ含量的影响1.3.1滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中BGP含量的影响模型组大鼠血清中BGP的含量比正常对照组显著降低。与模型组相比,阳性对照组大鼠血清中BGP的含量显著增高;且与正常对照组相比,无显著性差异。滋补肾阴组大鼠血清中BGP的含量与模型组相比明显增高,但仍明显低于正常对照组,而与阳性对照组相比,无显著差异。见表8。1.3.2滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中E2含量的影响模型组大鼠血清中E2的含量比正常对照组显著降低。滋补肾阴组大鼠血清中E2的含量与模型组相比,显著增高;但较之正常对照组仍显著降低。与阳性对照组相比,滋补肾阴组大鼠血清中E2的含量显著增高。见表9。1.3.3滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中PTH含量的影响模型组大鼠血清中PTH的含量比正常对照组显著增高。阳性对照组及滋补肾阴组大鼠血清中PTH的含量与模型组相比,显著降低;但较之正常对照组仍明显增高。滋补肾阴组大鼠血清中PTH的含量与阳性对照组相比仍明显增高。见表10。1.3.4滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中IGF-Ⅰ含量的影响模型组大鼠血清中IGF-Ⅰ的含量比正常对照组显著降低。与模型组相比,阳性对照组及滋补肾阴组大鼠血清中IGF-Ⅰ的含量皆显著增高;但较之正常对照组仍明显降低。滋补肾阴组大鼠血清中IGF-Ⅰ的含量与阳性对照组相比,无显著性差异。见表11。2体外实验2.1 MTT法测定不同实验条件对成骨细胞增殖的影响OB+10-6mol/L地塞米松组及OB+10-7mol/L地塞米松组的OD值均显著低于OB+正常血清组,但两者之间无显著性差异。OB+5%左归丸含药血清组、OB+10%左归丸含药血清组及OB+15%左归丸含药血清组的OD值均显著高于OB+10-6mol/L地塞米松组及OB+10-7mol/L地塞米松组,其中以OB+15%左归丸含药血清组增高最为明显;但与正常血清组相比,仍明显降低。这一结果说明:10-6mol/L地塞米松及10-7mol/L地塞米松均对成骨细胞的增殖有明显的抑制作用,而5%、10%及15%的左归丸含药血清均可明显促进成骨细胞的增殖,其中,15%的左归丸含药血清促进成骨细胞增殖的作用最为明显。所以下一步的实验选用10-7mol/L地塞米松以及15%左归丸含药血清作为干预条件。注:与OB+正常血清组比较:*P<0.05,**P<0.01;与OB+10-6mol/L地塞米松组比较:△P<0.05,△△P<0.01;与OB+5%左归丸含药血清组比较:▲P<0.05,▲▲P<0.01。2.2左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP-6、β-catenin蛋白表达的影响2.2.1左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α蛋白表达的影响较之正常血清组,地塞米松组Wnt3α蛋白的表达显著下调。左归丸含药血清组Wnt3α蛋白的表达与地塞米松组相比明显上调,但与正常血清组相比,仍明显降低。见图1。2.2.2左归丸含药血清对成骨细胞LRP-6蛋白表达的影响与正常血清组相比,地塞米松组LRP-6蛋白的表达显著下调。左归丸含药血清组LRP-6蛋白的表达较之地塞米松组明显上调,但与正常血清组相比,仍明显降低。见图2。2.2.3左归丸含药血清对成骨细胞β-catenin蛋白表达的影响地塞米松组β-catenin蛋白的表达较之正常血清组明显下调。与地塞米松组比,左归丸含药血清组β-catenin蛋白的表达明显上调,且与正常血清组相比,无显著性差异。见图3。2.3左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP-6、β-catenin mRNA表达的影响2.3.1 RNA提取纯度的检测和质量鉴定使用NanoDrop（?）ND-1000微量分光光度计测定RNA浓度及纯度,系统自动计算出A260/280,定量分析结果,见表13、图4。所有样本总RNA的A260/280均在1.8-2.0之间,说明所提取的RNA纯度高,无蛋白质和DNA的污染。经琼脂糖电泳成像后可看到清楚的两条带（见图4）:28S、18S,除此之外无其他杂带,且28S:18S≈2:1,证实所提总RNA完整,无异常断裂和丢失。1、2、3:正常血清组样本;M:marker;4、5、6:地塞米松组样本;7、8、9:左归丸含药血清组样本2.3.2扩增产物的溶解曲线各样品扩增产物的溶解曲线如图5,均为单一吸收峰,说明产物专一,单一片段反应特异性合格,无二聚体等杂带样品,可进行下一步荧光定量PCR反应。（a） Wnt3α（b） LRP-6（c）β-catenin（d）β-actin2.3.3左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3αmRNA表达的影响与正常血清组相比,地塞米松组芹归丸含药血清组Wnt3αmRNA的表达均明显下调;但左归丸含药血清组Wnt3αmRNA的表达较之地塞米松组显著上调。见图6。1、2、3正常血清组样本;4、5、6地塞米松组样本;7、8、9左归丸含药血清组样本;下同。2.3.4左归丸含药血清对成骨细胞LRP-6 mRNA表达的影响地塞米松组LRP-6 mRNA的表达较之正常血清组显著下调。与地塞米松组比,左归丸含药血清组LRP-6 mRNA的表达明显上调,但与正常血清组相比,仍明显下调。见图7。如下:对文献中较多的10个证候,应用方剂树形分析算法进行分析,对获得的计算结果总结如下。基本方

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略表
• 综述一 Wnt信号转导通路研究进展
• 综述二 糖皮质激素性骨质疏松症的发病机制及中药对其的影响
• 前言
• 第一部分 体内实验
• 材料方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 1 滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠骨组织形态计量学指标的影响
• 2 滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠胫骨OB及MSC Wnt1、LRP-5及β-catenin蛋白和mRNA表达的影响
• 3 滋补肾阴法对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠外周血血清中BGP、E2、PTH、IGF-Ⅰ含量的影响
• 讨论
• 1 糖皮质激素性骨质疏松症的中医机理探讨
• 2 滋阴补肾法对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗作用
• 3 滋阴补肾法治疗糖皮质激素性骨质疏松症的作用机理
• 小结
• 第二部分 体外实验
• 材料方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果
• 1 MTT法测定不同实验条件对成骨细胞增殖的影响
• 2 左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP-6、β-catenin蛋白表达的影响
• 3 左归丸含药血清对成骨细胞Wnt3α、LRP-6、β-catenin mRNA表达的影响
• 讨论
• 1 Wnt信号传导通路与成骨细胞
• 2 糖皮质激素（GC）对成骨细胞的抑制作用及滋阴补肾法对其的调节
• 3 糖皮质激素（GC）对Wnt信号传导通路的影响及滋阴补肾法对其的调节
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图