CCK-8对CIA小鼠脾细胞增殖及Th1/Th2细胞因子平衡的影响

论文摘要

目的:类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种病因不明的慢性炎症性自身免疫性疾病。其病理变化为中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T细胞浸润关节,导致滑膜的增生和新生血管的生成;这些细胞可释放出过量的趋化因子使更多的细胞聚集于炎性部位,并释放基质蛋白酶和细胞因子导致关节的破坏。目前临床和实验均表明:在RA的诱导和急性期以Th1型细胞因子的产生为主,而在疾病的缓解期与Th2介导的反应相关,提示抗原诱导的Th1/Th2细胞免疫应答失衡及炎症反应是其主要发病机制。CIA（collagen-induced arthritis）为胶原诱导性关节炎,是用Ⅱ型胶原（typeⅡcollagen,CⅡ）免疫对其敏感的鼠类,诱导多关节发生炎症,其与人类的RA在临床表现、组织学和免疫学特征方面很相近。CIA动物模型被认为是研究人类RA发病机制和探索治疗新方法的良好动物模型。胆囊收缩素（cholecystokinin,CCK）是广泛分布于体内多个系统的神经肽,作为神经递质或调质发挥重要作用,具有多种生物学功能。CCK-8是具有CCK全部活性的最小单位。CCK通过与细胞膜上的CCK受体结合介导其生理调节功能。研究已证实在巨噬细胞、T细胞、B细胞均表达CCK受体,说明CCK对免疫系统多靶位的广泛作用。最近研究表明CCK-8具有一定的抗内毒素休克和缓解类风湿性关节炎的作用,CCK-8对鈅孔戚血蓝蛋白诱导的小鼠Th1/Th2细胞反应具有调节作用,可抑制Th1型细胞因子IFN-γ的表达,增加Th2型细胞因子IL-4的表达。但CCK-8是否对CIA小鼠具有调节作用,其免疫学机制如何尚未见报道?因此本实验通过观察CCK-8对CIA小鼠脾细胞增殖和Th1/Th2细胞因子平衡的影响,探讨CCK-8在RA发病中的免疫调节机制,为治疗RA寻找新的靶点。方法:1健康的DBA/1小鼠18只,随机分为正常对照组（6只）和CIA组（12只）,造模第30天取正常对照组和CIA组小鼠的脾细胞,调整细胞浓度为2×105cell/孔,接种于96孔板中。将其分为9组给药,每组设6个重复孔:（1）正常对照组（NS组）:正常小鼠脾细胞中加入PBS;（2）CIA对照组:CIA小鼠脾细胞中加入PBS;（3）CⅡ（100μg/ml）组:CIA小鼠脾细胞加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（4）CCK-8(10-8mol/L)组:CIA小鼠脾细胞加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)。（5）CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)组:CIA小鼠脾细胞先加入CCK-8(终浓度为10-6mol/L)再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（6）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组:CIA小鼠脾细胞先加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（7）CⅡ+CCK-8(10-10mol/L)组:CIA小鼠脾细胞先加入CCK-8(终浓度为10-10mol/L)再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（8）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)组:CIA小鼠脾细胞先加入CR1409(终浓度为10-6mol/L)再加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)最后加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）:（9）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)组:CIA小鼠脾细胞先加入CR2945(终浓度为10-6mol/L)再加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)最后加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）。孵育54小时后加入3H-TdR继续孵育18小时用[3H]-TdR掺入法测脾细胞增殖,观察CCK-8对CIA小鼠脾细胞增殖的影响。2取CIA小鼠脾细胞将其分为8组,每组设3个重复孔:（1）对照组:脾细胞中加入PBS;（2）CⅡ（100μg/ml）组:脾细胞中加入CⅡ（100μg/ml）;（3）CCK-8(10-8mol/L)组:在脾细胞中加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L);（4）CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)组:在脾细胞中先加入CCK-8(终浓度为10-6mol/L)再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（5）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组:在脾细胞中先加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（6）CⅡ+CCK-8(10-10mol/L)组:在脾细胞中先加入CCK-8(终浓度为10-10mol/L),再加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（7）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)组:在脾细胞中先加入CR1409(终浓度为10-6mol/L)再加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)最后加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）;（8）CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)组:在脾细胞中先加入CR2945(终浓度为10-6mol/L)再加入CCK-8(终浓度为10-8mol/L)最后加入CⅡ（终浓度为100μg/ml）。孵育48h后用ELISA法检测上述脾细胞上清液中IL-4和IFN-γ的含量观察CCK-8对CIA小鼠Th1/Th2细胞因子平衡的影响。结果:1 CCK-8对CIA小鼠脾细胞增殖的影响:CIA对照组脾细胞cpm值（10137.02±885.98）较正常对照组（6476.60±595.82）增高（P＜0.05）,CⅡ（100μg/ml）组（21732.36±3449.73）较CIA对照组增高（P＜0.01）,单独CCK-8对脾细胞增殖无明显作用。CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)组、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组、CⅡ+CCK-8(10-10mol/L)组cpm值（9816.75±413.14、10937.11±1332.87、12996.21±1890.65）均较CⅡ（100μg/ml）组降低（P＜0.01）,CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CRl409(10-6mol/L)组、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)组cpm值（16252.12±2210.41、15145.39±3084.48）较CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组增高（P＜0.05）。2 CCK-8对CIA小鼠Th1/Th2细胞因子平衡的影响2.1 CCK-8对Th1型细胞因子IFN-γ的影响:CIA小鼠脾细胞上清液中IFN-γ的浓度:CⅡ组（107.96±0.81ng/L）较对照组（60.60±0.98ng/L）升高（P＜0.01）,CCK-8组（58.44±8.57ng/L）与对照组相比无明显作用,CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)组、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组IFN-γ的浓度（86.40±7.13ng/L、94.04±3.24ng/L）均较CⅡ组降低（P＜0.01）,CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)组及CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)组IFN-γ的浓度（101.99±3.20ng/L、102.80±4.43ng/L）较CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组均升高（P＜0.05）。2.2 CCK-8对Th2型细胞因子IL-4的影响:CIA小鼠脾细胞上清液中IL-4的浓度:CⅡ组（22.41±2.37ng/L）较对照组（25.56±2.08ng/L）降低（P＜0.01）,CCK-8组（26.73±1.53ng/L）较对照组无明显作用,CⅡ+CCK-8(10-6mol/L)组、CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组IL-4浓度（36.03±2.37ng/L、27.23±3.79ng/L）均较CⅡ组升高（P＜0.05）,CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR1409(10-6mol/L)组及CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)+CR2945(10-6mol/L)组IL-4的浓度（23.25±1.82ng/L、23.50±1.27ng/L）较CⅡ+CCK-8(10-8mol/L)组均降低（P＜0.05）。结论:CCK-8可抑制CⅡ诱导的小鼠脾细胞增殖作用。CCKR阻断剂可以部分阻断此作用,呈剂量依赖性。CCK-8可抑制CⅡ诱导的CIA小鼠脾细胞上清IFN-γ的表达增加和IL-4的减少,呈剂量依赖性,而CCKAR和CCKBR两种CCK-8的特异性受体阻断剂则部分阻断了CCK-8对CⅡ的这种作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 CCK-8对CIA小鼠脾细胞增殖的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 CCK-8对Th1/Th2细胞平衡的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 促炎性细胞因子与类风湿性关节炎
• 致谢
• 个人简历