论文摘要
我国是食管癌的高发区。目前,手术、化疗和放疗仍是肿瘤的主要治疗方法,但是都存在着一定局限性。多数食管癌患者到医院就诊时已属中、晚期,故食管癌预后差,平均5年生存率为10%。近年来,肿瘤生物治疗受到了人们的关注,并逐渐成为肿瘤的第四种治疗方法。其中,肿瘤免疫治疗不仅能提高宿主免疫功能,特异性杀伤肿瘤细胞,而且对正常组织细胞有较少的毒副作用而受到重视。肿瘤免疫治疗的目标是提高肿瘤细胞的免疫原性,加强免疫系统的识别和清除能力。具有免疫活性的细胞因子是免疫调节的重要因素,可以活化免疫细胞,增强免疫细胞的功能,有的细胞因子甚至可以直接杀伤肿瘤细胞。但是单纯应用细胞因子蛋白的治疗常因其在体内半衰期短,需要大量、持续用药,在收到一定的疗效同时,常产生严重的毒副作用,阻碍了细胞因子的临床应用。因此,通过适当载体,将细胞因子基因定向导入肿瘤细胞内,使其在宿主体内持续产生细胞因子,可增强机体免疫功能,在肿瘤局部发挥抗肿瘤作用。此外,如果载体为肿瘤细胞或负载肿瘤抗原的DC,在产生细胞因子的同时还可提供特异性抗原,诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应。白细胞介素27（Interleukin, IL-27）是2002年Pflanz等发现并命名的一种新的细胞因子,由活化的树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞产生。可诱导初始CD4+ T细胞向Th1（T helper type 1）细胞分化而促进Th1型免疫的发生,协同白细胞介素12（IL-12）产生干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）等细胞因子,具有免疫调节活性,参与了自身免疫性疾病、慢性炎症反应和某些感染性疾病的发病和调控。有研究表明,IL-27可通过诱导和增强小鼠脾细胞细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）活性和IFN-γ等细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用。因此,IL-27有望成为新的免疫治疗因子。由于该因子是新近发现的活性较强的细胞因子,还有许多问题有待于进一步研究。本研究主要目的是深入探讨IL-27在人食管癌中的抗肿瘤作用及其机理,为食管癌的基因治疗研究提供实验和理论依据。第一部分表达重组IL-27基因的人食管癌细胞Eca109/IL-27的建立目的:利用逆转录病毒作为载体将重组小鼠IL-27基因转染人食管癌细胞（Eca109）,建立能表达和分泌IL-27的肿瘤细胞（Eca109/IL-27）,并检测外源性IL-27基因转染对Eca109细胞体外增殖及其生物学性状的影响,为深入研究IL-27在食管癌中的抗肿瘤作用奠定基础。方法:将携带IL-27基因的逆转录病毒载体（LXSN/IL-27）,经过ψ2和PA317包装细胞两次包装,利用该逆转录病毒将IL-27基因导入人食管癌Eca109细胞,经G418筛选后获得表达IL-27的阳性细胞克隆Eca109/ IL-27。用RT-PCR检测目的基因的表达;ELISA法检测IL-27的分泌;免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜检测IL-27蛋白的表达;MTT比色法检测肿瘤细胞的体外增殖;流式细胞仪分析Eca109/IL-27细胞表面HLA-A,B,C（MHCI类分子）、HLA-DR（MHCII类分子）和CD80、CD86的表达。结果:1携带IL-27基因的逆转录病毒的病毒滴度为46×105 CFU/ml,其培养上清中IL-27的分泌量为157.24±5.9 pg/ml,可用于转染肿瘤细胞。2建立了能分泌IL-27的人食管癌Eca109/IL-27细胞,经RT-PCR以及激光共聚焦显微镜和ELISA证实在mRNA水平和蛋白水平IL-27均可稳定表达（P<0.01）,IL-27的分泌量为153.73±7.00pg/ml。表明外源IL-27基因已整合到Eca109/IL-27细胞的基因组中并高效表达。3 Eca109/IL-27细胞的形态特征及增殖反应与野生型Eca109细胞和Eca109/LXSN细胞均无明显差别（P>0.05）。4 Eca109/IL-27细胞的细胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表达水平与野生型Eca109细胞和Eca109/LXSN细胞无显著性差异（P>0.05）。结论:成功建立表达IL-27基因的人食管癌细胞（Eca109/IL-27）;IL-27基因导入Eca109细胞后,对细胞的形态和增殖及细胞表面分子的表达均无显著影响。第二部分IL-27对免疫细胞功能影响的体外研究目的:研究IL-27对人外周血淋巴细胞和裸鼠脾淋巴细胞免疫功能的影响。方法:将Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109细胞培养上清作用于人外周血淋巴细胞,用ELISA法检测诱导IL-12p70、IFN-γ、TNF-α和IL-4的产生情况,流式细胞仪检测CD4+、CD8+ T细胞的含量和细胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表达,乳酸脱氢酶（LDH）法检测杀伤性T细胞（CTL）活性;将上述细胞培养上清作用于裸鼠脾细胞,ELISA法检测IFN-γ的产生,LDH法检测杀伤活性。结果:1 IL-27对人外周血淋巴细胞免疫功能的影响Eca109/IL-27细胞培养上清可诱导人外周血淋巴细胞产生高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12p70等Th1类细胞因子,与Eca109/LXSN和Eca109细胞相比有非常显著性差异（P<0.01）,而Th2类细胞因子IL-4的分泌水平三组间无明显差异（P>0.05）;外周血淋巴细胞经Eca109/IL-27细胞的培养上清诱导后CD4+、CD8+ T细胞百分比显著增高（P<0.01）,CTL对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强（P<0.01）,细胞表面分子HLA-A,B,C、HLA-DR和CD80、CD86的表达水平提高（P<0.01）。2 IL-27对裸鼠脾细胞免疫功能的影响Eca109/IL-27细胞培养上清诱导裸鼠脾细胞产生IFN-γ为48.7±4.3 pg/ml,高于Eca109/LXSN和Eca109组（分别为6.3±1.5 pg/ml和4.9±1.4 pg/ml）（P<0.01）,对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强（P<0.01）。结论:IL-27能够增强淋巴细胞免疫功能和对肿瘤细胞的杀伤活性。第三部分IL-27在裸鼠体内的抗肿瘤效应及作用机理研究实验一IL-27对荷瘤裸鼠肿瘤生长及免疫调节作用研究目的:研究IL-27对荷瘤裸鼠肿瘤生长及其免疫调节作用影响。方法:将Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109细胞分别皮下和腹腔接种于裸鼠体内,观察成瘤性、肿瘤生长情况及荷瘤裸鼠生存期。免疫组化法检测裸鼠移植瘤组织NK细胞浸润;ELISA法检测脾细胞IFN-γ产生;LDH法检测脾细胞的杀伤活性;RT-PCR检测移植瘤组织中IL-27基因和其他细胞因子基因的表达。结果:1接种Eca109/IL-27细胞与Eca109/LXSN和Eca109细胞后,裸鼠成瘤率均为100%。接种Eca109/IL-27细胞裸鼠肿瘤生长速度明显慢于接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组（P<0.05）,裸鼠生存期延长（P<0.01）。2接种Eca109/IL-27细胞组肿瘤组织中有IL-27p28和IL-27EBI3基因的表达,而接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组肿瘤组织中未检测到IL-27p28和IL-27EBI3基因的表达。3接种Eca109/IL-27细胞组肿瘤组织中NK细胞浸润比率较接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组显著增高（P<0.01）。4接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠脾细胞IFN-γ的产生增加（P<0.01）;IFN-γ的产生与用灭活的野生型Eca109细胞再次诱导与否无关（P>0.05）。5接种Eca109/IL-27细胞的裸鼠脾细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强（P<0.01）。6接种Eca109/IL-27细胞组T-bet、IL-12Rβ2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达较接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组增高（P<0.05）。结论:转染IL-27的Eca109细胞在裸鼠体内产生了明显的抗肿瘤作用。IL-27促进荷瘤鼠移植瘤组织间质中NK细胞的浸润;提高了脾细胞产生IFN-γ的能力和杀伤活性;IL-27可促进荷瘤鼠移植瘤组织中细胞因子的表达。实验二IL-27诱导肿瘤细胞凋亡作用研究目的:研究IL-27对肿瘤细胞凋亡的影响,进一步研究其诱导细胞凋亡作用机制。方法:采用流式细胞仪分析体外培养的肿瘤细胞及体内肿瘤组织的细胞凋亡率;TUNEL法检测三组肿瘤组织细胞原位凋亡;电镜观察肿瘤组织细胞凋亡的超微结构变化;用RT-PCR和Western-blot法检测肿瘤组织凋亡相关基因Fas和Survivin的表达。结果:1体外培养的Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109细胞凋亡率无显著性差异（P>0.05）;然而,将这三种肿瘤细胞接种于裸鼠后观察,接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤细胞凋亡率较接种野生型Eca109细胞组和Eca109/LXSN细胞组显著增高（PI分别为:39.5±2.4%,12.5±0.3%和13.1±0.8%）（P<0.01）2 TUNEL法检测结果显示,接种Eca109/IL-27细胞组肿瘤组织内有灶性分布的凋亡细胞,细胞核内有棕黄色颗粒,接种Eca109/LXSN细胞组和Eca109细胞组肿瘤组织内仅见极少数散在分布的凋亡细胞。接种Eca109/IL-27组细胞凋亡率明显高于接种Eca109/LXSN细胞组和野生型Eca109细胞组（P<0.01）。3电镜观察可见,接种Eca109/IL-27细胞组肿瘤组织细胞呈典型的凋亡细胞形态,而接种Eca109和Eca109/LXSN细胞组肿瘤组织细胞呈典型的肿瘤细胞形态,未发现凋亡征象。4 RT-PCR结果显示,接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中Fas mRNA表达水平显著高于接种Eca109/LXSN细胞和野生型Eca109细胞组（P<0.01）;而Survivin mRNA在接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠瘤组织中的表达水平则显著低于接种Eca109/LXSN细胞和Eca109细胞组（P<0.01）,转染IL-27组Survivin与Fas的比值降低（P<0.01）。5 Western-blot结果显示,接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中Fas蛋白表达水平明显高于接种Eca109/LXSN细胞和野生型Eca109细胞组（P<0.01）;而Survivin蛋白在接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中的表达水平则明显低于接种Eca109/LXSN细胞和Eca109细胞组（P<0.01）,转染IL-27组Survivin与Fas比值降低（P<0.01）。结论:转染IL-27基因的人食管癌细胞所分泌的IL-27在体内诱导肿瘤细胞凋亡率增加,可能通过Fas/FasL途径实现的,与其下调肿瘤组织Survivin表达有关。实验三IL-27抑制肿瘤组织血管生成作用研究目的:研究IL-27对肿瘤组织血管生成的影响,进一步探讨其作用机制。方法:分别取接种Eca109/IL-27、Eca109/LXSN和Eca109细胞的裸鼠肿瘤组织,用免疫组化法检测三组肿瘤组织中CD34和VEGF的表达;RT-PCR检测MIG和IP-10 mRNA的表达。结果:1免疫组化法检测结果显示,接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中微血管数量明显低于接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组（分别为15.56±5.32、34.27±7.34和35.69±4.72）（P<0.01）;接种Eca109/ IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中VEGF的表达明显低于接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组（P<0.01）。2接种Eca109/IL-27细胞组裸鼠肿瘤组织中MIG和IP-10 mRNA表达水平明显高于接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组（P<0.01）。结论:转染IL-27的食管癌Eca109/IL-27细胞所分泌的IL-27可通过升高趋化因子MIG和IP-10的表达,降低细胞VEGF的表达,抑制肿瘤微血管生成,从而发挥抗肿瘤作用。