苹果砧木耐盐突变体的筛选及其鉴定

论文摘要

苹果是重要的果树树种之一,主要靠嫁接繁殖,其耐盐性主要取决于砧木。因此,选择利用具有较高耐盐能力的砧木是提高苹果耐盐性的关键。利用组织培养与诱变技术相结合选育抗性突变体,可提高耐盐砧木育种效率,获得优良的新种质。但是经诱变和耐盐性反复筛选而获得的突变体,不排除部分个体是由环境胁迫而产生的适应性改变,而并非稳定的遗传变异。因此,突变体的鉴定是诱变育种的关键环节之一。 本试验以苹果砧木78-48和EH-78-48为材料,以NaCl作为耐盐选择剂,采用辐射诱变和组织培养技术相结合的方法,对苹果耐盐突变体的筛选及其鉴定进行了系统研究。主要研究结果如下: 1.建立了78-48和EH-78-48的高效叶片再生体系,再生培养基为MS+BA2.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或MS+TDZ1.0mg·L-1+NAA0.1mg·L-1,暗培养时间20d最佳。 2.60Co-Υ辐射诱变明显抑制了78-48和EH-78-48植株的生长,诱变处理后两砧木畸形叶比例增加,叶片再生受到明显抑制。 3.选取诱变效应明显的植株叶片进行再生,采用NaCl 1.0%和1.2%作为选择压,对再生植株进行多代交替盐筛选,获得了耐盐性稳定的突变株系L和K。 4.对78-48及其耐盐突变体L1、L2、EH-78-48及其耐盐突变体K2的形态指标进行观察和测定,结果表明:耐盐突变体的存活率明显高于对照,受害率和受害指数低于对照,表现出较高的耐盐性。受害指数能够综合反映苹果砧木的盐害程度,能较准确地反映出盐胁迫对砧木的生长抑制作用,可作为描述苹果砧木耐盐性的形态学指标。 5.研究结果表明在盐胁迫条件下,苹果砧木细胞膜透性加大,MDA、O2-和Cl-含量升高,在处理期间耐盐突变体上述指标含量均显著低于对照,两者之间差异显著;SOD和POD酶活性、脯氨酸含量增加,在处理期间耐盐突变体明显高于对照,两者之间差异显著。Na-含量在盐胁迫条件下升高,K+含量降低,Na+/K+增大,但耐盐突变体的Na+/K+低于对照水平,说明突变体比对照更能忍受盐胁迫的伤害。 6.在盐胁迫条件下,苹果砧木耐盐突变体内多胺总量和精胺、亚精胺、腐胺含量都表现为先上升后下降的趋势,腐胺含量表现为先下降后上升的趋势,（Spd+Spm）/Put比值随着盐浓度的增加而升高。研究发现,不管是多胺总量、精胺、亚精胺、腐胺含量,还是（Spd+Spm）/Put比值,耐盐突变体都显著高于对照。 7.在盐胁迫条件下,苹果砧木体内IAA、GA和ZR含量和ZR/ABA比值逐渐降低;ABA含量增加,耐盐突变体ABA含量明显高于对照。 8.上述指标的相关分析结果表明,MDA含量、超氧阴离子含量、Cl-含量、

论文目录

• 引言
• 1 盐分对植物的生理生化影响
• 1.1 盐分对植物细胞膜系统的影响
• 1.2 盐分对内源激素和多胺含量的影响
• 2 植物耐盐育种研究进展
• 2.1 诱变技术在耐盐育种上的应用
• 2.2 分子标记在耐盐育种上的应用
• 3 植物耐盐相关基因克隆
• 3.1 耐盐相关基因研究
• 3.2 植物耐盐相关基因克隆
• 3.2.1 渗透调节有关的基因
• 3.2.2 与离子区域化相关的基因
• 3.2.3 保护酶基因
• 3.2.4 与转录因子有关的基因
• 4 本研究目的意义
• 材料与方法
• 1 试验材料
• 2 试验内容与方法
• 2.1 材料辐射诱变处理
• 2.2 78-48高效叶片再生体系的建立
• 2.2.1 激素种类对叶片再生的影响
• 2.2.2 暗培养时间对叶片再生的影响
• 2.2.3 辐射诱变对叶片再生的影响
• 2.3 耐盐突变体的筛选
• 2.4 耐盐突变体生理指标检测
• 2.4.1 游离脯氨酸含量测定
• 2.4.2 质膜透性测定
• +、K⁺离子含量测定'>2.4.3 Na⁺、K⁺离子含量测定
• -含量测定'>2.4.4 Cl^-含量测定
• 2.4.5 SOD、POD酶活性测定
• 2^-）含量测定'>2.4.6 丙二醛（MDA）和超氧阴离子（O₂^-）含量测定
• 2.4.7 可溶性蛋白质含量测定
• 2.4.8 内源多胺含量的测定
• 2.4.9 植物内源激素含量测定
• 2.5 耐盐突变体RAPD分析：
• 2.5.1 DNA的检测
• 2.5.1.1 DNA提取及检测
• 2.5.1.2 紫外吸收法
• 2.5.2 RAPD反应体系的建立
• 2.5.3 RAPD扩增产物检测
• 2.5.4 引物筛选
• 2.6 耐盐植株特异性带回收克隆及序列分析
• 2.6.1 从琼脂糖凝胶中回收DNA片断
• 2.6.2 目的DNA片断的克隆
• 2.6.3 目的DNA的测序
• 2.6.4 耐盐基因序列分析
• 2.7 苹果砧木耐盐突变体AFLP分析
• 2.7.1 酶切体系
• 2.7.2 接头连接
• 2.7.3 预扩增体系
• 2.7.4 选择性扩增体系
• 2.7.5 扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 2.7.6 电泳结果统计
• 结果与分析
• 1 辐射诱变对苹果砧木形态和生长的影响
• 1.1 辐射诱变对苹果砧木叶片形态的影响
• 1.2 辐射诱变对苹果砧木生长的影响
• 2 苹果砧木耐盐突变体的获得
• 2.1 78-48高效叶片再生体系的建立
• 2.1.1 不同激素种类对苹果叶片再生的影响
• 2.1.2 暗培养时间对苹果叶片再生的影响
• 2.2 辐射诱变对苹果砧木叶片再生的影响
• 2.3 诱变材料的NaCl筛选
• 2.3.1 NaCl胁迫下砧木及其耐盐突变植株的生长情况
• 2.3.2 NaCl胁迫下砧木及其耐盐突变株系的受害率和受害指数
• 3 耐盐突变体生理指标检测
• +、K⁺离子含量'>3.1 Na⁺、K⁺离子含量
• +含量变化'>3.1.1 Na⁺含量变化
• +含量变化'>3.1.2 K⁺含量变化
• +／K⁺比值的变化'>3.1.3 Na⁺／K⁺比值的变化
• 3.2 游离脯氨酸含量
• 3.3 质膜透性
• -离子含量'>3.4 Cl^-离子含量
• 3.5 SOD、POD活性
• 3.5.1 SOD活性变化
• 3.5.2 POD活性变化
• 2^-含量变化'>3.6 MDA和O₂^-含量变化
• 3.6.1 MDA含量变化
• 2^-含量变化'>3.6.2 O₂^-含量变化
• 3.7 可溶性蛋白质含量变化
• 3.8 多胺含量变化
• 3.8.1 精胺含量变化
• 3.8.2 亚精胺含量变化
• 3.8.3 腐胺含量变化
• 3.8.4 多胺总量和（Spm+Spd）／Put比值变化
• 3.9 植物内源激素含量变化
• 3.9.1 ABA含量变化
• 3.9.2 IAA含量变化
• 3.9.3 ZR含量变化
• 3含量变化'>3.9.4 GA₃含量变化
• 3.9.5 ZR／ABA比值的变化
• 3.10 质膜透性与生理生化指标的相关分析
• 4 苹果砧木耐盐突变体分子鉴定
• 4.1 基因组DNA提取和检测
• 4.2 苹果砧木耐盐突变体的RAPD分析
• 4.2.1 引物多态性分析
• 4.2.2 78-48及其突变体的多态性与遗传背景分析
• 4.3 多态性带克隆、转化和测序结果分析
• 4.3.1 PCR产物回收及载体连接检测
• 4.3.2 测序结果分析
• 4.4 苹果砧木耐盐突变体AFLP分析
• 4.4.1 供试材料的多态性带
• 4.4.2 遗传多样性分析
• 讨论
• 1 关于苹果砧木耐盐突变体筛选的问题
• 2 突变体耐盐性与生理生化指标的关系
• 2.1 突变体耐盐性的形态学分析
• 2.2 突变体耐盐性的生理水平鉴定
• 3 苹果砧木突变体耐盐性的分子鉴定
• 3.1 突变体的RAPD分析
• 3.2 突变体的AFLP分析
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 在校期间发表文章
• 作者简历
• 致谢
• 附录