本文主要研究内容
作者花敬涵（2019）在《β-环糊精糖基转移酶的催化机制及理性改造研究》一文中研究指出：药用辅料环糊精(CDs)是含有亲水性外部和疏水中心腔的环状低聚糖,由于它们具有能够与许多难溶的亲脂性分子形成水溶性包合物的独特优势,故被广泛应用于制药、纺织、农业、化妆品、化学和食品工业等领域。CDs一般由淀粉或淀粉衍生物经环糊精糖基转移酶(CGTase,EC 2.4.1.19)催化合成。CGTase属于α-淀粉酶家族,能催化四种反应:环化、偶联、歧化和水解,其中环化反应产生CDs是CGTase的特征反应,即CGTase催化淀粉的α-糖苷键裂解,一部分供体被分离出来作为受体以形成CDs。CGTase催化淀粉合成CDs,其产物通常以α-,β-和γ-CD的混合物形式存在(分别具有6、7和8个葡萄糖单元),这不利于CDs的分离纯化。因此,提高催化产物的专一性对具体种类环糊精的实际生产具有重要意义,即产物特异性。近年来提高环糊精的产物特异性一直是研究热点,主要有向反应体系中添加有机溶剂、对CGTase分子改造两种手段。本文基于来自Bacillus cereus的高效表达β-CGTase的工程菌,围绕提高其酶法合成CDs的产物特异性展开了一系列研究,建立了一种简便、高效、高选择性地合成CDs的方法,并探究了关键位点氨基酸的性质和酶催化特性之间的关系。首先,本论文对β-CGTase酶促合成CDs的催化机制进行研究,具体优化了底物淀粉的预处理方法对CDs产量的影响、酶促合成CDs的催化条件、醇类溶剂体系合成CDs的反应条件。实验结果表明底物淀粉经蒸汽处理或者糊化处理后可以大幅度提高CDs的产率;β-CGTase酶促合成CDs的最佳pH数值为8.5、最佳催化温度为55°C;催化体系中醇类溶剂的存在会影响CDs的产率和产物选择性,其中叔醇体系可以提高CDs产率(从54.95%提高到68.21%),仲醇体系显著影响产物特异性(β-CD/γ-CD:由6.25改善为8.05)。其次,采用荧光淬灭法及热力学计算探究了醇类溶剂和β-环糊精糖基转移酶的作用机理。荧光淬灭分析表明溶剂的结合常数和熵值对CDs的产率和产物特异性有影响;热力学参数揭示醇类溶剂和β-CGTase之间可能通过疏水作用力致使β-CGTase酶的结构发生了变化,从而对β-CGTase的催化特性产生影响,改变了该体系酶促合成CDs的产率和产物特异性。最后,对多种来源的CGTase的基因进行序列比对,发现Bacillus cereus来源CGTase的第47位氨基酸对CGTase合成CDs的产物特异性具有重要影响。以重组质粒pET22b/CGTase为模板,借助基因改造手段对该位置丙氨酸进行饱和突变研究,成功构建了十九株突变菌株;并通过CDs合成反应检测突变酶催化性能的改变,分析该位点氨基酸与CGTase产物特异性的关系。结果发现活性区域中第47位氨基酸位点为疏水性氨基酸时可以提高CDs(β-CD、γ-CD)的产率,而且催化产物有倾向于合成大环CDs(γ-CD等)的趋势,这说明提高β-CGTase的关键氨基酸附近的疏水作用力可能是催化合成大环CDs的有效策略。论文的研究结果进一步阐明了β-环糊精糖基转移酶的催化机制,为该酶的定向进化及实际应用提供了一定的借鉴意义。
Abstract
yao yong fu liao huan hu jing (CDs)shi han you qin shui xing wai bu he shu shui zhong xin qiang de huan zhuang di ju tang ,you yu ta men ju you neng gou yu hu duo nan rong de qin zhi xing fen zi xing cheng shui rong xing bao ge wu de du te you shi ,gu bei an fan ying yong yu zhi yao 、fang zhi 、nong ye 、hua zhuang pin 、hua xue he shi pin gong ye deng ling yu 。CDsyi ban you dian fen huo dian fen yan sheng wu jing huan hu jing tang ji zhuai yi mei (CGTase,EC 2.4.1.19)cui hua ge cheng 。CGTaseshu yu α-dian fen mei jia zu ,neng cui hua si chong fan ying :huan hua 、ou lian 、qi hua he shui jie ,ji zhong huan hua fan ying chan sheng CDsshi CGTasede te zheng fan ying ,ji CGTasecui hua dian fen de α-tang gan jian lie jie ,yi bu fen gong ti bei fen li chu lai zuo wei shou ti yi xing cheng CDs。CGTasecui hua dian fen ge cheng CDs,ji chan wu tong chang yi α-,β-he γ-CDde hun ge wu xing shi cun zai (fen bie ju you 6、7he 8ge pu tao tang chan yuan ),zhe bu li yu CDsde fen li chun hua 。yin ci ,di gao cui hua chan wu de zhuan yi xing dui ju ti chong lei huan hu jing de shi ji sheng chan ju you chong yao yi yi ,ji chan wu te yi xing 。jin nian lai di gao huan hu jing de chan wu te yi xing yi zhi shi yan jiu re dian ,zhu yao you xiang fan ying ti ji zhong tian jia you ji rong ji 、dui CGTasefen zi gai zao liang chong shou duan 。ben wen ji yu lai zi Bacillus cereusde gao xiao biao da β-CGTasede gong cheng jun ,wei rao di gao ji mei fa ge cheng CDsde chan wu te yi xing zhan kai le yi ji lie yan jiu ,jian li le yi chong jian bian 、gao xiao 、gao shua ze xing de ge cheng CDsde fang fa ,bing tan jiu le guan jian wei dian an ji suan de xing zhi he mei cui hua te xing zhi jian de guan ji 。shou xian ,ben lun wen dui β-CGTasemei cu ge cheng CDsde cui hua ji zhi jin hang yan jiu ,ju ti you hua le de wu dian fen de yu chu li fang fa dui CDschan liang de ying xiang 、mei cu ge cheng CDsde cui hua tiao jian 、chun lei rong ji ti ji ge cheng CDsde fan ying tiao jian 。shi yan jie guo biao ming de wu dian fen jing zheng qi chu li huo zhe hu hua chu li hou ke yi da fu du di gao CDsde chan lv ;β-CGTasemei cu ge cheng CDsde zui jia pHshu zhi wei 8.5、zui jia cui hua wen du wei 55°C;cui hua ti ji zhong chun lei rong ji de cun zai hui ying xiang CDsde chan lv he chan wu shua ze xing ,ji zhong shu chun ti ji ke yi di gao CDschan lv (cong 54.95%di gao dao 68.21%),zhong chun ti ji xian zhe ying xiang chan wu te yi xing (β-CD/γ-CD:you 6.25gai shan wei 8.05)。ji ci ,cai yong ying guang cui mie fa ji re li xue ji suan tan jiu le chun lei rong ji he β-huan hu jing tang ji zhuai yi mei de zuo yong ji li 。ying guang cui mie fen xi biao ming rong ji de jie ge chang shu he shang zhi dui CDsde chan lv he chan wu te yi xing you ying xiang ;re li xue can shu jie shi chun lei rong ji he β-CGTasezhi jian ke neng tong guo shu shui zuo yong li zhi shi β-CGTasemei de jie gou fa sheng le bian hua ,cong er dui β-CGTasede cui hua te xing chan sheng ying xiang ,gai bian le gai ti ji mei cu ge cheng CDsde chan lv he chan wu te yi xing 。zui hou ,dui duo chong lai yuan de CGTasede ji yin jin hang xu lie bi dui ,fa xian Bacillus cereuslai yuan CGTasede di 47wei an ji suan dui CGTasege cheng CDsde chan wu te yi xing ju you chong yao ying xiang 。yi chong zu zhi li pET22b/CGTasewei mo ban ,jie zhu ji yin gai zao shou duan dui gai wei zhi bing an suan jin hang bao he tu bian yan jiu ,cheng gong gou jian le shi jiu zhu tu bian jun zhu ;bing tong guo CDsge cheng fan ying jian ce tu bian mei cui hua xing neng de gai bian ,fen xi gai wei dian an ji suan yu CGTasechan wu te yi xing de guan ji 。jie guo fa xian huo xing ou yu zhong di 47wei an ji suan wei dian wei shu shui xing an ji suan shi ke yi di gao CDs(β-CD、γ-CD)de chan lv ,er ju cui hua chan wu you qing xiang yu ge cheng da huan CDs(γ-CDdeng )de qu shi ,zhe shui ming di gao β-CGTasede guan jian an ji suan fu jin de shu shui zuo yong li ke neng shi cui hua ge cheng da huan CDsde you xiao ce lve 。lun wen de yan jiu jie guo jin yi bu chan ming le β-huan hu jing tang ji zhuai yi mei de cui hua ji zhi ,wei gai mei de ding xiang jin hua ji shi ji ying yong di gong le yi ding de jie jian yi yi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自合肥工业大学的花敬涵，发表于刊物合肥工业大学2019-09-20论文，是一篇关于环糊精糖基转移酶论文,产物特异性论文,醇类溶剂论文,环糊精论文,饱和突变论文,合肥工业大学2019-09-20论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自合肥工业大学2019-09-20论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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