自体起搏细胞移植构建生物心脏起搏器的实验研究

论文摘要

目的:生物心脏起搏器（Biological Cardiac Pacemaker）是心脏起搏治疗领域的未来发展方向。其原理是利用细胞技术与基因治疗技术,将起搏基因导入非起搏细胞,构建一种“人造”的起搏细胞,然后植入体内使其发挥其起搏心室提高心率的作用。拟通过生物心脏起搏器的构建,探索治疗缓慢型心律失常类疾病的新方法,以克服电子心脏起搏器的缺点,最终达到使此类患者免除电子心脏起搏器植入的目的。本课题在我单位对骨髓干细胞的长期研究基础上,结合国内外关于生物起搏研究的最新进展,分以下3个阶段对自体生物心脏起搏器的构建进行探索。1.明确细胞移植技术构建自体生物心脏起搏的可行性:应用犬窦房结细胞进行自体心室肌内移植,探索自体起搏细胞移植治疗缓慢型心律失常类疾病的作用和效果,为后续实验摸索和建立相关技术、实验条件以及评价方法,并提供可行性分析;2.构建自体起搏细胞:利用携带hHCN2基因的重组腺病毒载体（Ad.hHCN2）,将hHCN2基因导入犬骨髓干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）以构建具有生理性起搏功能的起搏细胞（Ad.hHCN2-MSCs）;3.研究自体起搏细胞体内移植起搏心室的效果:将构建好的起搏细胞（Ad.hHCN2-MSCs）,通过细胞移植技术移植到完全性房室传导阻滞后的犬自体心室肌内,构建自体生物心脏起搏器,评价其起搏心室的作用和效果。方法:1.手术获取窦房结后,通过多种酶的联合消化技术分离获得窦房结细胞,选择单个自主搏动的窦房结细胞进行膜片钳研究,研究其起搏电流、动作电位等电生理学参数。2.将窦房结细胞悬液斜行注入钛夹标记处右心室前壁心外膜下,并在该处心外膜进行标记。3.细胞移植后两周后,射频消融希氏束或房室结建立完全性房室传导阻滞动物模型,并通过心脏电生理检查、移植部位的细胞学检查、免疫荧光染色等技术和方法,对窦房结细胞自体移植后起搏心室的效果进行评价。4.通过构建Ad.hHCN2重组腺病毒,将hHCN2基因导入犬骨髓干细胞（MSCs）。待其在MSCs稳定表达后,利用膜片钳技术对表达HCN2通道蛋白的MSCs进行电生理学研究,评价其起搏功能,并进一步优化基因转染方法。通过MSCs与乳鼠心肌细胞的体外联合培养,研究构建的起搏细胞在体外对心肌细胞的起搏效果。5.建立完全性房室传导阻滞的犬模型,然后将体外构建好的自体起搏细胞（Ad.hHCN2转染的犬骨髓干细胞）自体移植到心室肌内,通过采用体表心电图、24小时动态心电图、组织病理学技术、免疫荧光组织化学染色等多种检测手段综合评价其起搏心室的作用和效果,并研究这种生物起搏心律对于神经体液调节的反应能力。结果:1.酶消化法分离获得的犬窦房结细胞结构和功能保持完整,能够产生典型的起搏电流,并在体外自主搏动。2.将分离获得的窦房结细胞自体移植到完全性房室传导阻滞后的心室肌内,能够有效起搏心室,经神经递质反应性研究证实,这种异位起搏心律对异丙肾上腺素具有良好的反应性。3.对细胞移植部位的心室肌标本进行分离,证实移植的窦房结细胞能够在移植部位存活,同时也与心室肌细胞形成了功能性的缝隙连接结构。免疫组织化学研究进一步证实,移植细胞之间以及移植细胞与原有心室肌细胞之间均有缝隙连接蛋白表达,提示细胞间形成了电-机械耦联。4.Ad.hHCN2转染犬骨髓干细胞后,其转染效率约为70%,细胞状态良好。对转染后的MSCs进行膜片钳研究,可以记录到具有超极化电压激活以及时间依赖性特点的起搏电流,并且这种电流随电压的递增而不断增强,在超极化钳制电压为-105mV时完全激活,峰电流强度约为-400 pA,并具有起搏电流的典型特性。与乳鼠心肌细胞的体外联合培养实验表明,我们构建的起搏细胞能够提高乳鼠心肌细胞的搏动频率,表明其在体外环境下具有起搏功能。5.自体起搏细胞体内移植后第2周起,体表心电图检查提示移植组犬出现起源于细胞移植部位的室性自主心律。心室超速起搏实验提示实验组犬的室性自主心律的激动点比对照组具有更高的兴奋性。24小时动态心电图监测表明,从第2周起无突发或严重的心律不齐或紊乱。利用Holter计算机软件分析所得的实验组犬的平均心率、总心搏次数、生物起搏次数及生物起搏率等参数均优于对照组,并且这种心律对肾上腺素具有良好的反应性。免疫荧光组织化学研究提示自体移植的MSCs细胞能够在移植部位存活,并有效表达HCN2通道蛋白。结论:1、通过体外消化分离得到的窦房结细胞结构和功能保持完整,且移植到自体心室肌后,能有效提高心室率,并对神经递质的调节具有良好反应性。2、利用基因技术构建携带起搏基因的重组腺病毒载体,转染体外传代培养的骨髓干细胞后,经膜片钳技术和细胞联合培养实验证实这种构建的起搏细胞在体外环境下具有起搏功能。3、将构建好的起搏细胞自体移植到完全性房室传导阻滞犬心室肌后,能有效起搏心室并提高室性节律,发挥其作为生物心脏起搏器的作用,并且这种生物起搏心律具有良好的自动调节能力。4、自体生物心脏起搏器虽然能够提高完全性房室传导阻滞后的心室率,但这种生物起搏的心率仍低于正常的窦性心率,因此尚有待进一步改进和优化实验方法,以最终实现模拟窦性心率的目的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 犬窦房结细胞自体移植探索生物起搏治疗心脏传导阻滞的实验研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 起搏基因导入犬骨髓干细胞构建起搏细胞的实验研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 犬起搏细胞自体移植构建生物起搏器的实验研究
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述一:生物起搏:电信号的产生与传导
• 参考文献
• 综述二:生物起搏器的研究现状与展望
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢