西北太平洋深海沉积物微生物多态性分析

论文题目: 西北太平洋深海沉积物微生物多态性分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 海洋生物学

作者: 穆春华

导师: 包振民

关键词: 微生物多样性,深海沉积物,西北太平洋

文献来源: 中国海洋大学

发表年度: 2005

论文摘要: 利用分子生物学的方法来研究微生物生态,DNA质量起着十分重要的作用。其中包括:一DNA量的多少、二DNA的完整性、三所提DNA是否能代表微生物的种群多样性。1)本研究通过比较Zhou,Bath,Microwave及PVP等四种方法对DNA提取的影响表明:从DNA条带的强弱上来看,Bath法最不适合深海沉积物DNA的提取,Zhou法和Microwave法提取DNA量最多;从DNA完整性上来看,Zhou法最适合于深海微生物DNA的提取。2)利用紫外分光光度计对提取的DNA进行回收效率的检测发现,柱子法和电泳法的回收效率均低于25%,但柱子法回收效率较电泳法高。3)DGGE条带可以反映所检测样品的微生物种群数量多少。以三种提取方法和两种回收方法得到的DNA为模板,两组DGGE引物进行种群多样性比较表明,用Zhou法提取、柱子法回收的DNA得到了最多的DGGE带谱;同时610bp的片段可以获得较210bp片段更多的谱带。通过研究PCR反应条件对分子生物学方法检测微生物种群多态性的影响可见:1)高GC含量的模板不利于PCR扩增,但错配是造成PCR偏好性的决定性因素。2)退火温度升高会加剧因GC百分含量不同及错配造成的偏好:而低于47℃的退火温度可以有效的降低这两种因素引起的偏好。3)改变循环数不会有效的减小PCR偏好。同时,研究还表明,PCR产物中的条带代表的是群体中占有优势的物种。利用提取纯化的样品总DNA为模板,扩增了细菌和古菌16S rDNA片段,并构建了相应文库。通过对文库克隆子的ARDRA分析,探讨了文库OTU多样性,结果表明:1)对细菌而言,EcoRI的酶切图谱条带数为1-3条,共分为11个带型;RsaI酶切图谱的条带数多为1-6条,其中以3-4条居多。文库多样性分析表明,文库覆盖率为59-76%,且以SH5的覆盖率最低。样品F120401与F120614有最低的相似性指数;与SH5有最高的相似性指数。2)对于古菌,构建了SH4和SH5的16S rDNA文库,大部分(>80%)克隆子外源片段不能用EcoRI酶切,RsaI酶切带型复杂,表现出较细菌更为复杂的种群多样性。文库多样性分析表明,

论文目录:

前言

1 深海微生物特点及分类

1.1 深海生态环境特点

1.1.1 高压

1.1.2 黑暗

1.1.3 低温

1.1.4 高度净化能力

1.1.5 有机物含量低

1.2 深海微生物的开发利用

1.2.1 海洋药物的开发

1.2.2 生物活性物质

1.2.3 生物地球化学循环

1.3 深海微生物的多样性及其分类

2 深海微生物的研究方法

2.1 原位研究

2.2 分离培养

2.2.1 传统的分离培养方法

2.2.2 新分离培养方法

2.2.2.1 细胞微胶囊法

2.2.2.2 扩散小室法

2.3 分子生物学方法

2.3.1 荧光原位杂交

2.3.2 扩增片段长度多态性分析

2.3.3 末端限制性片段长度多态性

2.3.4 长度多态性PCR

2.3.5 限制性片段长度多态性

2.3.6 扩增的rDNA限制酶切分析

2.3.7 变性／温度梯度凝胶电泳

2.4 16S rDNA在多样性分析中的应用

3 存在的问题及本研究的目的意义

参考文献

第一章 DGGE分析微生物多样性的DNA提取、纯化及16S rDNA扩增偏好性探讨

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 DNA提取及纯化方法

1.2.1 深海沉积物微生物DNA提取

1.2.2 粗DNA的纯化

1.2.3 DNA的检测

1.3 16S rDNA片段的扩增

1.4 PCR产物的检测

1.4.1 琼脂糖电泳检测

1.4.2 DGGE检测

1.5 16S rDNA扩增偏好性探讨

1.5.1 材料

1.5.2 深海沉积物样品16S rDNA文库的构建及克隆测序

1.5.3 克隆质粒DNA的提取，酶切回收及浓度检测

1.5.4 PCR反应的模板及引物

1.5.5 PCR条件

1.5.6 PCR产物的酶切及检测

2 结果和分析

2.1 四种方法提取DNA效果的比较

2.2 两种方法对DNA的回收效果的比较

2.3 PCR产物的检测

2.3.1 琼脂糖检测

2.3.1.1 1310bp片段的扩增

2.3.1.2 210bp片段的扩增

2.3.1.3 610bp片段的扩增

2.3.2 210bp及610bp扩增产物的DGGE检测

2.3.2.1 210bp片段DGGE比较

2.3.2.2 610bp片段DGGE比较

2.4 反应条件对16S rDNA PCR扩增偏好性的影响

2.4.1 模板浓度对PCR偏好性的影响

2.4.2 退火温度对PCR偏好性的影响

2.4.3 循环次数对PCR偏好性的影响

3 小结

4 讨论

4.1 环境样品微生物DNA的提取

4.2 环境样品微生物DNA的纯化

4.3 不同模板PCR产物的检测

4.4 巢式PCR及降落PCR

4.5 PCR反应条件对产物偏好性的影响

参考文献

第二章西北太平洋深海沉积物微生物多样性ARDRA分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 沉积物样品的采集及保存

1.1.2 菌株及质粒

1.2 方法

1.2.1 沉积物DNA的提取及纯化

1.2.2 真细菌及古菌16S rDNA片段的扩增

1.2.3 16S rDNA片段的回收及文库的构建

1.2.4 菌落PCR及克隆的筛选

1.2.4.1 菌落PCR

1.2.4.2 插入片段的ARDRA分析

1.2.4.3 文库多样性分析

1.2.5 系统发生分析

2 结果和分析

2.1 深海沉积物总DNA的提取

2.2 细菌16S rDNA文库的构建以及ARDRA分析

2.2.1 16S rDNA片段的扩增及菌落PCR

2.2.2 插入片段Eco RI酶切图谱分析

2.2.3 16S rDNA片段Rsa I酶切图谱分析

2.2.4 文库种群多样性分析

2.2.5 微生物遗传多样性分析

2.2.5.1 五个样品总的分析

2.2.5.2 各个样品分析

2.2.5.3 克隆子遗传多样性分析

2.3 古菌16S rDNA文库的构建以及ARDRA分析

2.3.1 样品16S rDNA片段的扩增及菌落PCR

2.3.2 16S rDNA片段Eco RI酶切图谱分析

2.3.3 16S rDNA片段Rsa I酶切图谱分析

2.3.4 古菌16S rDNA文库的多样性分析

2.3.5 古菌16S rDNA系统发生分析

3 小结

4 讨论

4.1 环境样品总DNA 16S rDNA文库

4.2 深海微生物的物质和能量代谢

4.3 深海微生物的培养

参考文献

第三章西北太平洋深海沉积物细菌多样性的DGGE分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果和分析

2.1 样品Fl20614部分单克隆610bp及210bp片段的扩增

2.2 所选单克隆G+C含量及系统发生分析

2.3 两片段DGGE分析

2.4 西北太平洋深海沉积物DGGE分析

3 小结

4 讨论

4.1 DGGE的优缺点

4.2 DGGE技术在微生物生态研究中的应用

参考文献

附图

博士期间发表文章

致谢

发布时间: 2005-10-26

参考文献

[1].深海沉积物微生物多样性及其与环境相互关系的研究[D]. 王鹏.中国海洋大学2005
[2].太平洋暖池区深海沉积物中微生物分子生态学研究[D]. 曾润颖.厦门大学2003
[3].近海细菌多相分类和基因组研究以及深海沉积物宏基因组分析[D]. 霍颖异.浙江大学2012
[4].深海沉积物细菌Pseudoalteromonas sp.SM9913和Myroides profundi D25胞外蛋白酶对有机氮降解的作用机制研究[D]. 冉丽媛.山东大学2014
[5].深海沉积物细菌和丝状真菌的基因组学研究[D]. 秦启龙.山东大学2010
[6].深海沉积物细菌Pseudoaiteromonas sp.SM9913适应环境的生活方式及其生理与遗传机制[D]. 糜自豪.山东大学2015
[7].深海沉积物和共生关系中海洋微生物的多样性[D]. 廖丽.浙江大学2012

西北太平洋深海沉积物微生物多态性分析

猜你喜欢