论文摘要
目的:应用复制缺陷型重组腺病毒（Adenovirus,AdV）为载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元和促进周围神经再生的研究,已成为神经修复研究领域的前沿课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的转染受损神经元及神经并高效表达,但由于宿主对病毒载体的免疫反应,使导入的基因不能在体内长时间高水平表达,从而限制了导入基因的治疗作用的发挥。本实验将将携带LacZ基因的AdV （AdLacZ）与不带外源基因的Ad0或与携带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白（Cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4immunoglobulin,CTLA4Ig ）基因的AdV （AdCTLA4Ig）通过微量注射导入大鼠腰膨大脊髓实质内,比较共同转染AdCTLA4Ig后β-半乳糖苷酶（β-gal）在脊髓表达水平变化;并通过对脊髓淋巴细胞亚群分类染色的观察、血清抗病毒抗体和中和抗体滴度检测,以探讨CTLA4Ig对AdLacZ表达的影响及其诱导机体的免疫耐受的作用和机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠160只,体重200～250g。将大鼠随机分成两组,每组80只。对照组（A组）导入AdlacZ+Ad0 ,实验组（ B组）导入AdlacZ+AdCTLA。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻（75-100mg/kg+5mg/kg）,麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉旁开0.8mm处注射AdlacZ（1×109pfu/ml）和Ad0（5×109pfu/ml）各1μl（A组）或AdLacZ（1×109 pfu/ml）和AdCTLA（5×109 pfu/ml）各1μl（B组）。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。两组在转染病毒后12个不同的时间点鼠尾静脉取血2ml;在转染后10个不同时间点,对两组动物脊髓进行厚50μm的连续冰冻横切片,计数A组与B组中5-溴-4-氯-3-吲-口杂-β-D-半乳糖苷（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside X-gal ）染色阳性的切片数,分析比较两组LacZ基因在脊髓表达的高峰期和持续时间;检测血清抗病毒中和抗体滴度;通过脊髓切片淋巴细胞亚群分类染色,观察CD68、CD4和CD8淋巴细胞的浸润情况。统计学方法:应用SPSS12.0软件,所得数据用均数±标准差表示,组间行成组比较t检验。P值<0.05有统计学意义。结果1共同转染的AdCTLA对AdLacZ在脊髓表达的影响:A组在转染后第一天即可观察到β-gal的表达,蓝染仅限于细胞核。转染后第2天胞体和突起逐渐被蓝染,转染的细胞数逐渐增多。转染的高峰期为28天,持续时间为2周。B组在转染后第一天即可观察到β-gal和CTLA4Ig的表达,转染的高峰期为28天,B组的X-gal染色阳性表达时间约为4周。AdCTLA和AdLacZ基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.6cm区段,有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤240片。转基因神经元在注射同侧表达较对侧强烈。脊髓阳性切片计数显示两组β-gal在脊髓表达的高峰期均在2～8天,统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数无显著差异（P>0.05）。2共同转染的AdCTLA在脊髓对细胞免疫的影响:淋巴细胞亚群分类染色观察:A组在病毒导入后24小时内即出现CD68浸润,2天后开始出现CD8淋巴细胞浸润,3天时开始出现极少量CD4淋巴细胞浸润。病毒导入后6天CD68逐渐消退,免疫反应则以CD8淋巴细胞浸润为主,伴有极少量CD4细胞浸润。在转染后第8天CD8细胞逐渐增多,2周时达高峰,其浸润程度较B组严重;持续到第6周时仍有少量浸润。B组病毒转染后1～6天,脊髓内CD68、CD8和CD4细胞的浸润程度与A组相似。在转染后第8天CD8细胞亦逐渐增多,2周达高峰;持续到第4周CD4、CD8细胞基本消退。两组CD4细胞8天后均稍有增加但浸润的数量都很少,并且与CD8消退的时间基本一致。3共同转染的AdCTLA在脊髓对细胞免疫的影响:抗病毒中和抗体滴度测定:A组转染病毒后第3天血清中可检测到抗病毒中和抗体,逐渐增加至第3周达到高峰并一直稳定在这一水平直至第6周。B组在转染后第3天,抗病毒中和抗体同样也被检测出,逐渐增加至第4周达到高峰并一直稳定在这一水平直至第6周。与A组相比B组抗体滴度水平稍低,但在统计学上两组无显著差异（P>0.05）。结论:将AdV介导的CTLA4Ig基因注入脊髓能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长共同导入其它外源基因在脊髓的表达,但不影响基因表达强度。AdCTLA4Ig对体液免疫应答的抑制作用不明显。
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标签：腺病毒论文; 基因论文; 脊髓论文; 淋巴细胞亚群分类论文; 抗病毒中和抗体论文;