磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及免疫学快速检测方法的建立

论文摘要

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）在临床上主要用于预防和治疗细菌感染性疾病，还常作为饲料添加剂在动物生产中长期应用。然而过量使用会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，因此在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已倍受关注，而磺胺二甲氧嘧啶（SDM）在磺胺类药物的使用中占有很大比例。因此，研究出一种操作简便、快速、灵敏的测定SAs残留的方法，对于畜产品的安检具有实际意义。本研究在分析磺胺二甲氧嘧啶分子结构和免疫原性的基础上，运用单克隆抗体技术生产了单抗，并组装了其免疫学快速检测试剂盒和试纸条。主要研究结果如下：1．用重氮化方法将SDM偶联于牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成了人工免疫原BSA-SDM和包被抗原OVA-SDM，通过紫外（UV）、SDS-PAGE和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定，表明BSA-SDM偶联成功，获得了高价、敏感、特异的抗血清。2．用BSA-SDM免疫Balb／C小鼠5只，4次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠1只，应用细胞融合技术筛选出1B4、3D9、4E1共3株敏感特异的杂交瘤细胞，用体内诱生腹水法制备SDM mAb，经鉴定，其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1：3.2×102、1：5.12×102、1：8.1×102，腹水效价分别为1：2.56×105、1：2.56×105、1：5.12×105，亲和常数（Ka）分别为2.16×109、3.28×109、1.71×1010（L／mol），其中亲和力最高的4E1株阻断ELISA测定其IC50为16.64ng／ml，与磺胺间甲氧嘧啶的交叉反应率为5％，与其他同类化合物无CR。本实验制备的SDM mAb可用于SDM残留检测的免疫学试验。3．应用SDM mAb，依据酶联免疫吸附实验和胶体金免疫层析试验（GICA）原理，分别组装了SDM残留快速检测阻断ELISA试剂盒和快速检测免疫金标试纸（SDM-Strip）。SDM-Kit的标准曲线呈S型，符合4参数logit曲线拟合，线性检测范围为1.0～128.0ng／ml。并用于检测尿液中磺胺二甲氧嘧啶的残留，试剂盒进行猪尿中的磺胺二甲氧嘧啶残留检测可以在一个小时内完成；试纸条则可以在8到10分钟内完成。两种产品均具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合于SDM残留快速检测的推广应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 食品安全与兽药残留
• 1.2 磺胺类药物在畜牧行业中的应用情况
• 1.3 国内外磺胺类药物的监控情况
• 1.4 磺胺类药物的特性和毒性作用
• 1.4.1 化学特性
• 1.4.2 制菌机理
• 1.4.3 毒性作用
• 1.5 磺胺类药物残留检测方法概述
• 1.5.1 微生物学检测法
• 1.5.2 理化检测方法
• 1.5.3 免疫学检测方法
• 1.5.4 三类检测方法的优缺点
• 1.5.5 检测方法发展趋势
• 1.6 国内外关于免疫学检测磺胺类药物检测的报道
• 1.7 研究目的及意义
• 1.8 本研究的主要内容和技术路线
• 1.8.1 主要内容
• 1.8.2 技术路线
• 第2章 磺胺二甲氧嘧啶人工抗原的合成与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 溶液
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 人工抗原的合成
• 2.2.2 人工抗原的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人工抗原的鉴定结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 关于SDM半抗原的设计
• 2.4.2 关于SDM人工抗原的制备方法
• 2.4.3 关于SDM人工抗原的免疫原性
• 2.4.4 关于SDM人工抗原的鉴定方法
• 2.5 小结
• 第3章 磺胺二甲氧嘧啶单克隆抗体的制备及鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 SDM mAb杂交瘤细胞株的建立
• 3.2.2 SDM mAb的免疫学特性鉴定
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于小鼠免疫
• 3.3.2 关于杂交瘤细胞株的筛选方法
• 3.3.3 关于杂交瘤细胞株的克隆化
• 3.3.4 单克隆抗体特性
• 3.3.5 影响因素、失败原因及分析
• 3.3.6 关于单抗亲和力测定和交叉反应性
• 3.4 小结
• 第4章 磺胺二甲氧嘧啶免疫学快速检测方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 仪器和试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 SDM阻断ELISA检测试剂盒的研制
• 4.2.2 胶体金快速检测试纸条的制备
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 SDM-Kit的标准曲线
• 4.3.2 SDM-kit的交叉反应性
• 4.3.3 胶体金技术的应用
• 4.3.4 试纸条的组装
• 第5章 论文总体讨论和结论
• 5.1 总体讨论
• 5.1.1 全抗原的合成
• 5.1.2 单克隆抗体的制备
• 5.2 总体结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果
• 详细摘要