论文摘要
研究背景肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是慢性肾脏疾病（chronic kidney disease, CKD）进展到终末期肾脏疾病（end stage renal disease, ESRD）的共同通路和最主要病理改变之一。大量动物及临床实验表明,在各种原发和继发性肾脏疾病中,肾间质纤维化程度比肾小球硬化程度与肾功能的关系更为密切,是反映肾功能下降严重程度和判断预后最重要的指标。肾小管上皮细胞转分化（epithelialto mesenchymal transition, EMT）是肾间质纤维化的早期且可逆阶段,细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积是肾间质纤维化的主要组织学改变。研究表明转化生长因子-β1 （transforming growth factor, TGF-β1）在这一过程中起关键作用。TGF-β1/Smad2-3信号通路是TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积的主要途径。热休克蛋白47（heat shock protein 47, HSP47）是热休克蛋白家族的一种胶原特异性分子伴侣,能与多种类型的胶原和前胶原特异性结合,调控胶原的表达,在多种器官纤维化过程中起重要作用。研究显示HSP47过度表达与肾脏纤维化密切相关,并成为肾脏纤维防治的目标之一。HSP47主要表达于表型转化的肾小管上皮细胞,受TGF-β1调控,抑制HSP47表达能够减轻肾脏纤维化。肾小管上皮细胞EMT过程中伴有热休克蛋白亚族的产生,而热休克蛋白参与EMT的研究目前尚不多,基于以上分析,我们认为HSP47可能与慢性肾脏疾病肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积有关。因此,本实验从体内体外两方面研究肾小管上皮细胞EMT中HSP47的作用,并进一步阐述其可能的作用机制。第一章HSP47在UUO模型大鼠中的表达及其对肾小管上皮细胞转分化的影响目的阐明HSP47在UUO模型大鼠肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积中的作用,探讨以HSP47为靶点抑制肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积的策略。方法12周龄SD雄性大鼠,体重280～320g。随机分为假手术组（Sham组）、UUO模型组（UUO组）、UUO模型+超声联合脂质微泡+HSP47反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, antisenseODNs）组（antisenseODNs组）以及UUO模型+超声联合脂质微泡+HSP47正义寡核苷酸（sense oligonucleotides, senseODNs）组（senseODNs组）。每组18只,再随机分为3天组,7天组,14天组三个亚组（每组6只）。按分组于第3、7和14天处死大鼠,取结扎侧肾脏。运用HE、Masson染色观察各组大鼠肾脏组织形态学改变,采用免疫组化方法检测UUO组大鼠不同时间肾脏组织HSP47.波形蛋白（Vimentin）、紧密连接蛋白（Zona occludens-1, ZO-1）、Ⅰ型胶原（CollagenⅠ, ColⅠ）的表达,运用Western blot及Real-time PCR检测各组大鼠14天时各组大鼠肾脏组织HSP47、ZO-1、Vimentin、ColⅠ的表达。结果HE和Masson染色显示,与Sham组相比,UUO组大鼠随梗阻时间延长,肾小管损伤程度、间质纤维化程度及炎症细胞浸润逐渐增加（p<0.05）。与UUO组相比,antisenseODNs组上述病变程度较同时间UUO组减轻（p<0.05）, senseODNs组无明显差别（p>0.05）。免疫组化显示,与Sham组相比,UUO组大鼠随梗阻时间的延长肾脏组织HSP47、Vimentin、ColⅠ表达上调（p<0.05）,而ZO-1表达下调（p<0.05）。与Sham组相比,14天时antisenseODNs组HSP47蛋白及mRNA表达明显降低（p<0.05）,同时ZO-1蛋白及mRNA表达上调（p<0.05）, Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表达下调（p<0.05）,纤维化程度减轻；senseODNs组HSP47、ZO-1、Vimentin、ColⅠ蛋白及mRNA表达无明显变化（p>0.05）。结论UUO模型大鼠肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积过程中,HSP47表达上调；抑制HSP47表达能部分逆转肾小管上皮细胞EMT,抑制ECM生成。第二章HSP47在肾小管上皮细胞中的表达及其对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响目的阐明HSP47在TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT及ECM沉积中的作用,探讨以HSP47为靶点抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT及ECM沉积的策略。方法用lOng/ml TGF-β1刺激HK-2细胞（TGF-β1组）,通过细胞免疫荧光、Western blot及Real-time PCR检测HSP47、Vimentin、ZO-1的表达,通过Western blot及Real-time PCR检测Ⅰ型胶原（CollagenⅠ, ColⅠ）和Ⅳ型胶原（CollagenⅣ, ColⅣ）的表达；转染HSP47 siRNA （HSP47siRNA组）及HSP47阴性对照组（HSP47siRNA（-）组）,阴性对照为无基因抑制效果的一段siRNA,再予TGF-β1刺激,通过细胞免疫荧光、Western blot检测HSP47表达,通过Western blot、Real-time PCR法检测HK-2细胞Vimentin、ZO-1、Col、ⅠColⅣ的表达变化。结果10ng/ml TGF-β1刺激后,HK-2细胞Vimentin、ColⅠ和ColIV蛋白及mRNA呈时间依赖性表达升高（p<0.05）, ZO-1蛋白及mRNA呈时间依赖性表达降低（p<0.05）,而HSP47蛋白及mRNA也呈时间依赖性表达升高（p<0.05）。与TGF-βⅠ组相比,HSP47siRNA组HK-2细胞HSP47蛋白及mRNA表达明显下调（p<0.05）,同时ZO-1蛋白及mRNA表达上调（p<0.05）, Vimentin. ColⅠ和ColⅣ蛋白及mRNA表达下调（p<0.05）;HSP47siRNA （-）组ZO-1、Vimentin、ColⅠ和ColⅣ的蛋白及mRNA表达无明显变化（p>0.05）。结论TGF-β1诱导HK-2细胞EMT及ECM沉积过程中伴有HSP47表达升高；下调HSP47可部分逆转HK-2细胞EMT,抑制ECM生成。第三章HSP47通过调节Smad3的活性参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化目的阐明HSP47参与调控TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT及ECM沉积的可能机制,为靶向HSP47防治肾脏纤维化提供理论依据。方法用10ng/ml TGF-β1刺激HK-2细胞（TGF-β1组）,通过Western blot方法检测细胞中Smad3、p-Smad3的表达水平；转染HSP47 siRNA（HSP47siRNA组）及HSP47阴性对照组（HSP47siRNA（-）组）,阴性对照为无基因抑制效果的一段siRNA,再予TGF-β1刺激,通过Western blot方法检测Smad3、p-Smad3、HSP47的表达变化。结果TGF-β1促进Smad3磷酸化,上调p-Smad3/Smad3表达（p<0.05）,在30分钟时达到峰值,随后稍下降,在24～48小时达到另一峰值。与TGF-β1组相比,HSP47siRNA组HSP47蛋白表达下降（p<0.05）,同时p-Smad3/Smad3表达下调（p<0.05）; HSP47siRNA（-）组p-Smad3/Smad3表达无明显变化（p>0.05）。结论TGF-β1诱导HK-2细胞p-Smad3表达上调；HSP47通过调节Smad3的活性参与调节TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT及ECM的生成。
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