猪MHC Ⅱ类反式激活因子CIITA基因2个突变体的鉴定及其多克隆抗体的制备

论文摘要

猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）是黄病毒科瘟病毒属的一个成员,所引起的猪瘟是一种高度传染性和致死性的疾病。近年的研究表明,猪瘟病毒在免疫猪的扁桃体、淋巴结和睾丸等多个器官持续性感染,猪瘟病毒在宿主体内的持续性感染是该病反复发作难以根绝的主要原因。MHC Ⅱ类反式激活因子（Major Histocompatibility Class Ⅱ Transactivator, CIITA）,是一个重要的共激活因子,其主要作用是通过蛋白的羧基端与结合到MHC Ⅱ类基因启动子上的多个转录因子相互作用,成为这些转录因子的支架,共同发挥对MHC Ⅱ类分子表达的调控作用。本实验室之前的研究结果表明,在猪瘟病毒感染的猪外周血淋巴细胞和体外培养的PK-15细胞中,主要组织相容性复合体Ⅱ （Major Histocompatibility Class Ⅱ, MHC Ⅱ）的表达水平均出现明显下调。CⅡTA是调节MHC Ⅱ表达的关键性分子,本研究的目的在于克隆猪CⅡTA基因,制备抗CⅡTA蛋白的多克隆抗体,使用制备的多克隆抗体检测真核转染的CⅡTA蛋白在PK-15细胞中的表达,探索CⅡTA蛋白的表达以及随后的MHC Ⅱ的表达与猪瘟病毒感染的关系,为进一步探索猪瘟病毒持续性感染的机制打下基础。本实验通过分离成年长白猪外周血淋巴细胞并抽提总RNA, RT-PCR扩增猪的CIITA基因,对扩增得到的猪CIITA基因的测序分析表明,我们获得了3条猪CIITA基因的序列,分别命名为CIITA4、CIITA8和CIITA-N,其中,CIITA4基因与参考基因（登录号为AY084053.1）的核苷酸序列的同源性达到99.4%,氨基酸同源性为98.6%；序列比对时我们还发现,CIITA8基因的核苷酸序列在其ORF的929-968位出现了40bp的碱基丢失的情况,CIITA-N基因的核苷酸序列在其ORF的225-368位和926-968位分别出现了144bp和40bp的碱基丢失；对CIITA8和CIITA-N进行氨基酸推导分析发现,因为926-968位基因片段的丢失,使得这两个基因的终止密码TGA提前,CIITA8和CIITA-N编码的蛋白质序列被缩短。所以本实验所获得的3条基因序列CIITA4、CIITA8和CIITA-N编码的蛋白质长度分别为565aa、312aa和264aa,初步推测这种核苷酸片段的丢失可能与CIITA基因的前体mRNA的选择性剪切有关。本研究扩增包含CIITA4基因3’端的723bp的核苷酸片段并将其亚克隆到原核表达载体PET-32a+上,成功构建PET-CIITA4-C原核表达载体并将其转化到大肠杆菌BL-21中进行IPTG的诱导表达。鉴定重组蛋白CIITA4-C的表达形式后,用Ni-NTA亲和层析的方法纯化重组蛋白并对其进行复性,复性后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体并对制备的抗体进行反应性和效价的检测。同时,我们还构建了包含CIITA4基因ORF的真核表达载体PCDNA3.0-GFP-CIITA4,并成功在PK-15细胞上表达。使用制备的抗CIITA4蛋白的多克隆抗体检测转染了PCDNA3.0-GFP-CIITA4的PK-15细胞中的CIITA4蛋白的表达情况,并且探索了表达CⅡTA4蛋白后对猪瘟病毒在PK-15细胞中的复制的影响,结果表明,表达CⅡTA4蛋白后,猪瘟病毒E2蛋白的表达没有明显变化,CⅡTA4蛋白在PK-15细胞中的表达与猪瘟病毒感染的相互关系还需进一步研究。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 猪瘟病毒概述

1.2 猪瘟病毒的致病机理和持续性感染机制

1.3 MHC Ⅱ类反式激活因子及其结构

1.3.1 人的CⅡTA及其结构

1.3.2 猪的CⅡTA及其结构

1.4 IFN-γ诱导CⅡTA基因表达以及随后的MHC Ⅱ基因表达的机制

1.5 CⅡTA与细菌感染的相互关系

1.6 CⅡTA与病毒感染之间的相互关系

1.6.1 病毒阻断IFN-γ与细胞膜上的IFN-γ受体结合

1.6.2 病毒干扰JAK-STAT信号传导途径

1.6.3 病毒干扰CⅡTA对MHC Ⅱ类基因表达的反式激活作用

1.6.4 CⅡTA分子与病毒复制的相互关系

1.7 本研究的目的和意义

第二章材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器和设备

2.1.2 猪血样品、所需载体、细胞、病毒和实验动物

2.1.3 实验试剂

2.2 实验方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 本研究所用引物

2.2.3 CⅡTA基因的克隆和序列分析

2.2.4 PET-CⅡTA4-C原核表达载体的构建

2.2.5 抗CⅡTA4蛋白多克隆抗体的制备

2.2.6 PCDNA3.0-GFP-CⅡTA4真核表达载体的构建

2.2.7 PCDNA3.0-GFP-CⅡTA4真核表达载体在PK-15细胞上的表达

2.2.8 CⅡTA4蛋白的表达与猪瘟病毒感染的关系

第三章实验结果

3.1 猪CⅡTA基因的克隆和序列分析

3.1.1 猪CⅡTA基因的克隆

3.1.2 猪CⅡTA基因的序列分析

3.2 猪CⅡTA基因原核表达载体的构建

3.3 抗CⅡTA4蛋白多克隆抗体的制备

3.3.1 PET-CⅡTA4-C原核表达载体在大肠杆菌BL-21中的表达

3.3.2 重组蛋白CⅡTA4-C表达形式的鉴定

3.3.3 重组蛋白CⅡTA4-C的Western-blot鉴定

3.3.4 重组蛋白CⅡTA4-C的纯化

3.3.5 抗CⅡTA4蛋白的多克隆抗体与重组蛋白CⅡTA4-C的反应

3.4 猪CⅡA基因真核表达载体的构建

3.5 PCDNA3.0-GFP-CⅡTA4真核表达载体在PK-15细胞上的表达

3.6 抗CⅡTA蛋白的多克隆抗体与CⅡTA4蛋白的反应和抗体效价测定

3.7 CⅡTA4蛋白的表达与猪瘟病毒感染的相互关系

第四章讨论

4.1 CⅡTA基因前体mRNA的选择性剪切

4.2 PET-CⅡTA4-C原核表达载体的构建和CⅡTA4-C重组蛋白的表达、纯化和复性

4.3 抗CⅡTA蛋白多克隆抗体反应性和抗体效价

4.4 CⅡTA4蛋白的表达与猪瘟病毒感染的关系

第五章结论

参考文献

致谢

猪MHC Ⅱ类反式激活因子CIITA基因2个突变体的鉴定及其多克隆抗体的制备

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢