几种分离自水稻产菌核真菌的生物学特性研究及鉴定

论文摘要

水稻纹枯病是水稻生产上最重要的三大病害之一，每年造成严重的经济损失。纹枯病是由丝核菌属真菌引起的水稻茎干和叶鞘病害的统称，包括Rhizoctonia solani Kühn、Rhizoctonia oryzae和Rhizoctonia oryzae-sativae等，不同真菌在培养性状、引起的病害在症状和危害部位上稍有差别。前期的研究发现分离自水稻纹枯病病斑的10个产菌核的真菌菌株培养性状有明显的差异，因此本文对它们进行了系统的生物学性状和遗传多样性的比较研究，以期为源自水稻的不同丝核菌菌株的多样性提供知识积累。生物学性状的研究主要包括菌落形态、核型、菌丝直径和对水稻的致病性，不同pH值、温度、碳源、氮源等培养条件对各菌株生长的影响等。结果表明菌核在固体培养基上的分布方式主要有3种：随机分布如rcol、wh-68、wh-79、B-10和wh-81，分布于培养皿中如wh-87、wh-81和wh-62，分布于培养皿边缘如wh-1和wh-94。有性阶段属于瓜亡革菌（Thanatephorus sp．）的菌株wh-1和wh-94的核型为多核，有性阶段属于角担菌的wh-87、wh-81、wh-90和wh-62为双核。Wh-68、wh-79和B-10为双核，而Rcol为杂核，即绝大多数为双核，部分细胞为多核甚至单核。多核类丝核菌wh-1和wh-94的菌丝直径明显大于wh-87、wh-81、wh-90和wh-62等双核菌。不同菌株对水稻的致病性存在显著差异，以wh-1和wh-94最强，而Wh-68、wh-79和B-10对供试的水稻品种基本无致病性。不同菌株在pH 6.0-7.0、25℃-30℃条件下，生长速度最快。在含淀粉、脯氨酸、硫铵酸、甘氨酸或丙氨酸的的查彼克（czapek）固体培养基上生长速度最快，在含乳糖和赖氨酸的查彼克培养基上生长速度最慢。在最适宜的碳源、氮源条件下，各菌株的生长速度、菌核形成数目、菌核干重趋于一致。wh-68、wh-79和B-10在PDA平板上产生如针头大小的微菌核，与其他的菌株存在显著差异，仅由形态学很难确定其分类地位，所以对其进行了分子鉴定。wh-68的18S rDNA与Rhizoctonia sp．AG-A同源性98％，与Ceratobasidium sp同源性99％。扩增结果表明，ITS序列与Sclerotium hydrophilum 100％同源，所以确定其为稻球小菌核病菌（Sclerotium hydrophilum Sacc），也称为喜水小核菌（球小菌核），属半知菌亚门真菌。水稻丝核菌菌株的遗传多样性的研究采用了RAPD技术。通过对模板DNA浓度、Taq酶、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、以及变性时间、循环次数、退火温度等因素的探索，确定了优化的RAPD反应体系。利用优化好的引物从s300-s399（上海sangon）共筛得到62条扩增条带清晰、谱带丰富的引物。利用62条随机引物对供试的7个菌株进行扩增，共获得591个RAPD标记。其中多态性标记537个，占90.86％。聚类表明表明当相似系数为0.55时可将供试菌株分为2个类群，其中第一类群为为单一的一个类群，包括菌株wh-1和wh-94，第二类群包括三个亚类群，分别为第一亚类群（Rcol和wh-87）和第二亚类群（wh-62、wh-81和wh-90），聚类结果与其生物学特性基本符合。菌株Rcol含有两种类型的ITS，即Ceratobasidium oryzae-sativae AG-Bb和Thanatephorus cucumeris AG-1-IA的ITS。s393对wh-94和Rcol的扩增也发现了一条wh-87（Ceratobasidium sp．）缺少而wh-94（Thanatephorus）和Rcol同时具备的特征带，序列分析表明为Thanatephorus sp．18S rDNA部分序列。为Rcol菌株是杂合菌株提供了进一步的证据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 水稻病原菌中产菌核真菌的主要种类
• 2 丝核菌的特征和分类
• 2.1 丝核菌属真菌的特征
• 2.2 丝核菌的分类
• 3 R.SOLANI种的概念
• 4 丝核真菌的病原学研究
• 5 基于核糖体基因簇的DNA分析技术
• 6 DNA分子标记技术在丝核菌遗传多样性研究中的应用
• 6.1 随机扩增多态DNA（Randomly amplifiedpoly）
• 6.2 基于分子杂交的DNA分析技术
• 6.3 扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Potymophism AFLP）
• 7 本研究的内容和目的
• 第二章 几种分离自水稻产菌核真菌的生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基和试剂及供试CN源
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌落形态的研究
• 1.2.2 菌丝特性研究
• 1.2.3 致病性测定
• 1.2.4 不同pH值条件对各菌种的生长速率影响
• 1.2.5 温度对各菌株菌丝生长以及菌核萌发的影响
• 1.2.6 不同碳源、氮源各菌株的生长情况
• 2 结果分析
• 2.1 不同菌株菌落形态比较
• 2.2 不同菌株的核型观察
• 2.3 不同菌株菌丝体的宽度测量以及比较
• 2.4 致病性测定
• 2.5 不同温度下不同菌株的生长速率比较以及菌核萌发情况
• 2.6 不同pH条件下不同菌株的生长速率比较
• 2.7 不同碳源、氮源条件对各菌株菌丝生长的影响
• 2.8 不同碳源、氮源条件对各菌株菌核生长的影响
• 2.9 小结与讨论
• 第三章 菌株WH-68的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 质粒抽提用溶液
• 1.1.4 其它溶液及试剂
• 1.1.5 限制性内切酶及其它酶类、试剂盒及其它试剂
• 1.1.6 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株培养（用于基因组DNA的提取）
• 1.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.3 菌株WH-68 ITS和18S rDNA区的PCR扩增
• 1.2.4 特异性扩增片段的回收
• 1.2.5 回收产物与克隆载体连接
• 1.2.6 利用大肠杆菌感受态细胞转化连接产物
• 1.2.7 重组质粒的提取及鉴定
• 1.2.8 克隆序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 18s rDNA分析
• 2.1.1 18s rDNA扩增结果
• 2.1.2 克隆的检测
• 2.1.3 18s rDNA测序结果
• 2.1.4 18s rDNA序列分析
• 2.2 菌株wh-68 ITS区段的序列分析
• 2.2.1 ITS序列扩增
• 2.2.2 克隆的检测
• 2.2.3 ITS测序结果
• 2.2.4 ITS序列分析
• 2.3 小结与讨论
• 第四章 各菌株的RAPD分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 扩增引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 RAPD反应体系及条件优化
• 1.2.2 RAPD引物筛选
• 1.2.3 RAPD分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RAPD条件优化结果与分析
• 2.1.1 DNA模板及模板DNA浓度对PCR结果的影响
• 2.1.2 引物浓度和Mg2+浓度对PCR结果的影响
• 2+浓度和dNTP浓度对PCR结果的影响'>2.1.3 Mg²⁺浓度和dNTP浓度对PCR结果的影响
• 2.1.4 变性时间对RAPD的影响
• 2.1.5 退火温度对RAPD的影响
• 2.1.6 循环次数对RAPD的影响
• 2.1.7 RAPD优化结果
• 2.2 引物筛选结果分析
• 2.3 RAPD分析
• 2.3.1 供试菌株的扩增情况
• 2.3.2 RAPD结果分析
• 2.3.3 聚类分析
• 2.3.4 聚类结果
• 2.4 特征带的序列分析
• 2.4.1 特征带的克隆
• 2.4.2 序列比对分析
• 2.4.3 结果分析
• 2.5 小节与讨论
• 参考文献
• 致谢