论文摘要
本文对冬凌草甲素诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡的调节机制进行了较为系统的研究,主要阐述了冬凌草甲素在人宫颈癌HeLa细胞和人成纤维肉瘤HT1080细胞中通过不同的途径对自噬和凋亡进行调节。此外,本文还对Fas激动型抗体CH11诱导的HeLa细胞的自噬和凋亡的调节机制进行了初步探讨。结果表明,冬凌草甲素可以诱导HeLa细胞和HT1080细胞同时发生凋亡和自噬。加入冬凌草甲素后,两株细胞均呈现细胞皱缩,浮起变圆,核周边出芽,形成很多凋亡小体等典型的凋亡特征,Hoechst33258荧光染色亦发现细胞核缩小,且染色致密,染色质发生断裂,形成粒状颗粒;同时,两株细胞也发生了自噬,表现为自噬溶酶体的染料MDC募集到胞浆中,自噬相关蛋白Beclinl表达显著增加,而LC3由Ⅰ型向Ⅱ型的转化也增加。然而,冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡在这两株细胞中的关系却不尽相同,其对自噬和凋亡的调节机制亦不相同。在HeLa细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬是对抗凋亡而发挥保护作用的。加入自噬的特异性抑制剂3-MA后,可以显著的增加冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制率及凋亡率。PKC途径在此过程中发挥着促进冬凌草甲素诱导的自噬对抗凋亡的作用。PKC的抑制剂staurosporine在抑制冬凌草甲素诱导的自噬的同时显著增加凋亡率;而用PMA激活PKC后可以促进自噬而抑制凋亡。Raf-1的抑制剂GW5074及JNK MAPK的抑制剂SP600125均可以抑制冬凌草甲素诱导的自噬,并提高凋亡率和细胞死亡率;而ERK和p38 MAPK的抑制剂仅提高冬凌草甲素诱导的细胞死亡,对自噬没有影响。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素诱导的Raf-1、JNK及p-JNK表达的上调均可被staurosporine所抑制,而PMA却可进一步促进其上调;但是staurosporine却不影响冬凌草甲素诱导的ERK、p-ERK、p38及p-p38表达的下调。可见,在本系统中,PKC是通过调节其下游的Raf-1和JNK来发挥促自噬、抗凋亡作用的。此外,冬凌草甲素可以诱导ROS的产生,ROS发挥促进凋亡和自噬的作用。加入ROS清除剂NAC后,冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡均被显著抑制,而且NAC可以逆转冬凌草甲素诱导的Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8等与凋亡、自噬相关的蛋白表达的改变。经流式细胞术检测,加入冬凌草甲素后1h即有大量的ROS产生,并且其持续增加,这说明ROS为冬凌草甲素诱导HeLa细胞死亡的主导因素。随后,我们还发现在冬凌草甲素诱导的HeLa细胞的自噬和凋亡中,抑制Ras和PARP后可促进自噬和凋亡;抑制NF-κB后自噬和凋亡均被抑制;抑制p53后可抑制自噬,促进细胞死亡;caspase家族、caspase-8和caspase-9抑制剂均可以在抑制凋亡的同时显著提高自噬率;Fas途径在此不起主导作用。在HT1080细胞中,冬凌草甲素诱导的自噬是协同凋亡而促进细胞死亡的。加入3-MA后,可以显著的抑制冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制及凋亡率。在此过程中,Ras、Raf-1、ERK、JNK和p38均发挥保护作用,分别抑制它们后,均可以显著提高冬凌草甲素诱导的细胞生长抑制和凋亡;Raf-1和JNK不参与自噬的调节;Ras、ERK和p38发挥抑制自噬的作用。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素可以时间依赖性的诱导上述蛋白表达的下调;并且Ras抑制剂manumycin A可以进一步诱导Raf-1、ERK和p-ERK的下调,而不影响JNK和p38的表达。可见,Ras通过调节ERK发挥对抗冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡的作用。此外,NF-κB的抑制剂PDTC和p53的抑制剂pifithrin-α可以显著抑制冬凌草甲素诱导的自噬和凋亡。蛋白免疫印迹表明,冬凌草甲素可以时间依赖性的激活NF-κB和p53;PDTC可以抑制冬凌草甲素诱导的p53的激活;pifithrin-α则对NF-κB的激活无影响。可见,NF-κB通过调节p53发挥着促进冬凌草甲素诱导的凋亡和自噬的作用。Fas激动型抗体CH11也可以剂量依赖性的诱导HeLa细胞同时发生自噬和凋亡,3-MA抑制自噬后可以显著增加CH11诱导的凋亡率,表明自噬是对抗凋亡的。加入Fas拮抗型抗体UB2可以抑制CH11诱导的自噬和凋亡,提示CH11诱导的自噬和凋亡是Fas介导的。此外,caspase-8抑制剂可以降低CH11诱导的凋亡率和细胞生长抑制,但对自噬没有影响;JNK抑制剂SP600125在抑制CH11诱导的自噬的同时促进凋亡。进一步研究发现,CH11可以剂量依赖的诱导JNK的激活,并且3-MA可以抑制JNK激活。提示,JNK参与了CH11诱导的自噬,其发挥促进自噬、对抗凋亡的作用。总之,本论文探讨了冬凌草甲素和Fas激动型抗体CH11诱导人肿瘤细胞自噬和凋亡的调节机制,首次发现了共同调节自噬和凋亡的信号转导途径,为阐明自噬和凋亡的调控奠定了基础。