论文摘要
第一部分大鼠2-AAF/PH模型中肝卵圆细胞的增殖模型的建立以及肝卵圆细胞的分离、鉴定及培养目的建立大鼠2-AAF/PH肝卵圆细胞增殖模型,探讨其分离、鉴定和培养的方法。方法大鼠每天灌喂2-乙酰氨基芴,剂量为15mg/kg,第5天停药并在10%水合氯醛全麻下行2/3大部肝切除术。第6天继续喂药,连续一周。对照组只是用生理盐水代替2-乙酰氨基芴,其余步骤一样。分别于手术后第2、6、10、12、16、21天麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠取肝脏标本,每个时间点取3只大鼠,绘制肝卵圆细胞增殖曲线图；取肝卵圆细胞增殖高峰期大鼠,采用改良的二步胶原酶灌注消化加密度梯度离心法分离肝卵圆细胞,用流式细胞仪、细胞免疫荧光、透射电镜鉴定肝卵圆细胞。结果2-AAF/PH模型成功诱导肝卵圆细胞增殖,同时还发现肝卵圆细胞的增殖高峰在术后10天左右,对照组无肝卵圆细胞出现。分离的肝卵圆细胞呈铺路石样生长,流式细胞仪检测OV6阳性细胞占85.36%±7%，细胞免疫荧光显示细胞表达肝卵圆细胞标志物OV6, AFP, CKI9, ALB, C-kit,透射电镜显示核浆比大,胞浆内细胞器少,表现为不成熟细胞特性。结论2-AAF/PH模型成功诱导肝卵圆细胞增殖,肝卵圆细胞增殖顶峰在术后10天左右,改良的两步胶原酶灌注消化加梯度密度离心法可以分离出纯度较高的肝卵圆细胞,为我们后续研究肝卵圆细胞的性质奠定了基础。第二部分EMT参与的肝卵圆细胞皮下接种裸鼠转分化为间叶组织瘤目的建立肝卵圆细胞种植到裸鼠皮下模型,研究肝卵圆细胞的可塑性。方法将大鼠肝卵圆细胞系LE/6细胞种植到50只雌性裸鼠皮下,观察有无肿块生长,HepG2细胞做阳性对照接种到5只裸鼠皮下。肿块通过HE染色,免疫组化,透射电镜,荧光原位杂交,激光共聚焦以及Western blot鉴定其性质。结果50只裸鼠有22只生成皮下肿块（阳性率44%）,对照组5只全部生成皮下肿瘤（阳性率100%）。HE染色显示LE/6细胞生成的肿块结构和HepG2形成的肿瘤完全不同,前者更像间叶组织瘤,免疫组化显示肿块表达间叶组织标志物vimentin, SMA, desmin和S-100,透射电镜找到间叶组织特异性标志物致密体,荧光原位杂交确定了肿块来源于接种的LE/6细胞,激光共聚焦显示Snail和vimentin, snail和N-cadherin共表达,Western blot显示Snail、vimentin和N-cadherin高表达,而E-cadherin低表达。结论肝卵圆细胞接种到裸鼠皮下能转分化为间叶组织瘤,EMT参与了这一转变过程,肝卵圆细胞在局部微环境刺激下具有很强的可塑性。第三部分：肝卵圆细胞皮下接种形成的间组织瘤移植入肝脏的转分化目的：探讨肝卵圆细胞皮下接种形成的间叶组织瘤再种植入肝脏,长期观察肝卵圆细胞衍生的间叶组织瘤能否转分化为肝癌组织。方法：肝卵圆细胞种植裸鼠腋下皮肤形成间叶组织瘤后,在移植到20只雌性裸鼠肝实质内,观察裸鼠腹部变化,对照组直接注射肝卵圆细胞到裸鼠肝实质内。取肝内形成的肿瘤做HE、免疫组化、透射电镜,明确肿瘤性质。结果：20只接种间叶组织瘤的裸鼠有3只形成肝内肿瘤（成瘤率15%）,对照组无一只裸鼠形成肝内肿瘤。HE染色可见肝内肿瘤由大部分的间叶细胞和少量异型上皮样细胞组成,免疫组化显示间叶细胞表达vimentin和SMA,而异型上皮细胞则表达肝细胞标志物HepPar1,透射电镜显示异型上皮细胞和肝癌细胞类似。结论：肝卵圆细胞皮下接种形成的间叶组织瘤再种植入肝脏能部分转化为肝癌细胞,形成肝癌肉瘤,其转化机制与EMT和MET密切相关,局部微环境对肝卵圆细胞的分化起到重要的作用,肝卵圆细胞通过EMT和MET的反复作用有可能变成肿瘤干细胞。