论文摘要
皮肤创伤愈合过程复杂,分为伤口止血期、炎症反应期、增殖期和组织重塑期。不同愈合阶段都受到多种因素的控制和调节,如果某一个或多个环节出现病理异常,那么正常的愈合过程就可能无法完成。慢性伤口不愈,作为异常的伤口愈合不良的一种,给病人的日常生活带来严重影响。近些年来,利用基因敲除手段,在活体水平研究某种基因对皮肤创伤愈合的影响,被科学界广泛应用。Gpr48（Lgr4）是一类富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体,由于其现在配体不明确,因此被称为“孤儿”受体。最近,Gpr48已经被证实参与多种器官发育调控。本实验室的实验发现,它在皮肤角质细胞表达丰富,还控制毛发的发育和毛发周期,可见它与皮肤关系密切。因此,我们提出一个假设：Gpr48影响皮肤的创伤愈合。本实验的目的是研究Gpr48基因缺失对小鼠皮肤创伤愈合的影响。通过在Gpr48+/+和Gpr48-/-小鼠上建立皮肤全层厚度创伤模型,发现Gpr48的缺失会造成创伤愈合明显延迟并表现为大量炎症浸润和毛细血管新生,而且导致多种炎症因子、趋化因子和生长因子的转录水平表达上调和延长,还导致了MAPK和NF-KB信号途径的异常激活。而后,在体外水平研究发现：Gpr48缺失明显减弱了人表皮细胞HaCaT的迁移能力,这进一步反应了Gpr48确实能够影响皮肤伤口愈合。具体内容如下：一、Gpr48基因敲除小鼠繁殖与基因型鉴定饲养成年Gpr48+／-小鼠,使雌雄鼠合笼交配,母鼠产下的小鼠理论上会出现三种基因型：Gpr48+/+、Gpr48+/-和Gpr48-／-。利用普通PCR、X-ga1染色和表型观察的方法鉴定子代小鼠基因型。选取同窝出生的Gpr48+／+和Gpr48-／-小鼠6对进行后续实验。实验结果表明：综合普通PCR、X-ga1染色和表型观察的方法能够准确无误的鉴定小鼠的基因型。二、皮肤全层厚度创伤模型的建立和伤口的观察选取8-10周龄同窝的Gpr48+／+和Gpr48-/-小鼠,用打孔器在背部皮肤上制造圆形8mm厚度的损伤,在创伤的第0天、第1天、第3天、第5天、第8天、第13天观察小鼠伤口的愈合情况,并进行拍照和伤口直径的测量。实验结果表明：Gpr48敲除小鼠愈合速度较同窝野生型小鼠明显变慢,在愈合的第3天、第5天、第8天、第13天差异具有显著性（p<0.05）。可见Gpr48基因缺失能够导致小鼠皮肤伤口愈合延迟。三、Gpr488基因的缺失对小鼠皮肤伤口愈合的组织学和分子水平影响及其机制伤口部位的皮肤取材,进行常规HE染色观察和细胞增殖、炎症反应相关蛋白的免疫组化半定量研究；其次,检测在伤口愈合的不同时间多种炎症细胞因子、生长因子的转录水平表达情况,再次,对影响小鼠伤口愈合的可能细胞信号通路蛋白进行检测。实验结果表明：Gpr48基因缺失小鼠在伤口愈合的各个阶段炎症反应均比野生型强烈,表现为炎症细胞大量聚集、肉芽组织累积、再上皮化过程延缓、细胞增殖能力降低,在愈合后期（第8天、第13天）还出现较多的新生毛细血管。免疫组化结果显示：在伤口愈合的整个过程中,Gpr48-/-小鼠真皮伤口处白细胞数目都比野生型小鼠显著提高；在伤口增殖期,Gpr48-/-小鼠表皮和真皮细胞增殖能力较野生型小鼠低；角质细胞炎症反应较野生型小鼠明显增高。RealtimePCR证实：Gpr48-/-小鼠中多种炎症细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）和趋化因子（CC构型和CXC构型）在创伤后相比野生小鼠均明显表达上调。同时,在Gpr48-/-小鼠中MAPK/ERK、NF-Kb、STAT等与炎症反应密切相关的信号通路蛋白活性增强。这些结果证实：Gpr48缺失小鼠呈现炎症反应过度和伤口愈合不良,MAPK、NF-Kb和STAT参与该异常过程的调节。四、Gpr48基因缺失对HaCaT表皮细胞迁移的影响利用免疫组化和实时定量PCR的方法,检测小鼠Gpr48基因在皮肤中的表达与定位,发现Gpr48基因主要表达在表皮以及其附属结构毛囊、皮脂腺、汗腺中。进一步利用RNA干扰的实验手段,构建Gpr48Knockdown的HaCaT细胞株。通过细胞划痕实验和检测与表皮细胞迁移密切相关的细胞外基质胶原酶MMP1,和其抑制酶TIMP1的表达,研究Gpr48基因缺失对角质细胞迁移能力的影响。实验结果表明：Gpr48基因的缺失会导致HaCaT细胞迁移能力降低,胶原酶MMP1的表达水平较正常细胞明显降低,说明角质细胞降解胶原蛋白的能力变差,从而影响表皮细胞在细胞外基质上的快速迁移能力,表现为伤口愈合不良。
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