成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞对C6胶质瘤的趋向性研究

论文摘要

在神经外科领域，胶质瘤的治疗一直是神经外科工作者面临的最大挑战之一，因为胶质瘤在中枢神经系统肿瘤疾病中发病率最高，约占全部原发性肿瘤的40%-50%左右。目前临床上治疗胶质瘤以手术治疗为主，辅以化疗、放疗、中医治疗、免疫治疗等手段进行综合治疗。这种方案虽能产生一定疗效，但胶质瘤的预后仍然不容乐观。靶向治疗的出现给我们带来了新的希望，但由于携带目的基因或药物的病毒载体存在半衰期短、趋向性弱和安全性等问题，目前未能取得预期的疗效，值得我们深入研究。最近，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）作为一种新型的载体而备受科学工作者的关注。BMSCs来源于中胚层，是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。与神经干细胞（neuralstem cell, NSC）和胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）等相比，BMSCs具容易获取、方便培养、低免疫原性、不涉及伦理问题等优点，近年来已成为干细胞领域研究的热点。根据BMSCs具有的生物学特性和对肿瘤的趋向性，目前很多研究者关注其在胶质瘤靶向治疗中的应用，将其作为一种载体用于胶质瘤的治疗成为的研究热点。而BMSCs的分离、培养、鉴定、分化等基础研究，作为进一步临床应用的基础，也成为BMSCs研究的重点。BMSCs在体内向胶质瘤的迁移过程中，受周围脑组织微环境的影响，可能使其分化而影响其对肿瘤区域迁移，最后到达胶质瘤部位的有效治疗细胞很少，阻碍其发挥治疗胶质瘤的作用。我们考虑通过在体外模拟体内的微环境，让BMSCs分化为较均一的神经细胞后，再进行移植，可能是解决上述问题的有效方法。成神经细胞分化的BMSCs（neurally differentiated bonemarrow mesenchymal stem cells, N-D-BMSCs）可部分模拟颅内微环境中BMSCs分化产生的细胞，但尚不确定N-D-BMSCs是否对胶质瘤产生趋向性。如果N-D-BMSCs能够向胶质瘤迁移，其主要的机制仍待阐明。基于以上问题，本论文，在前面学者研究NSC和BMSCs分化的基础上，首先，比较了营养因子和化学试剂诱导对BMSCs在体外诱导分化为神经细胞的作用差异，并进一步探讨N-D-BMSCs对C6胶质瘤细胞的趋向性研究，以及VEGF、MMP等分子在BMSCs迁移过程中的作用。鉴于以上的思路，我们的研究内容如下：第一部分BMSCs成神经细胞分化目的：观察两种新方案在体外诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的效果。方法：取SD大鼠股骨的骨髓细胞，利用Percoll法分离BMSCs，并且进行培养、纯化及鉴定。取第3代细胞，应用两种不同的方法进行诱导。方法一（营养因子诱导）:含10%胎牛血清的（FBS）的α-MEM、2%B27、20ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）、20ng/ml表皮生长因子（EGF）、10ng/ml脑源性神经营养因子（BDNF）；方法二（化学诱导）：含10%FBS的α-MEM、2%B27、10μmol/L全反式维甲酸（ATRA）、10mmol/L Bt2CAMP，联合诱导细胞。对照组用含10%FBS的α-MEM的标准培养基培养。分化进程中对细胞进行形态观察，最后对细胞进行免疫荧光染色鉴定，对比分化效果。结果：两种方法诱导后，细胞均出现胞体回缩、突触伸展，呈现出神经细胞形态。免疫荧光染色显示两种方法诱导的细胞不同程度的表达成熟神经细胞标志物（NeuN）、神经细胞骨架标志物（NF-H）和神经前体细胞标志物（Nestin）。方法一中Nestin（16.37±0.31）%的表达高于方法二中Nestin（10.58±0.16）%的表达，方法一中NeuN（43.53±1.34）%和NF-H（40.76±0.53）%表达低于方法二中NeuN（47.63±1.06）%和NF-H（51.39±0.37）%的表达。结论：两种方法均能诱导骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经细胞。两者相比，方法一诱导分化的神经前体细胞较多，更接近颅内微环境；方法二更多的使BMSCs分化为成熟神经细胞。第二部分N-D-BMSCs对C6胶质瘤细胞的趋向性目的：探讨N-D-BMSCs在体外和体内向C6胶质瘤细胞趋向性的机制。方法：在体外实验，采用Transwell小室共培养系统观察N-D-BMSCs和C6胶质瘤条件培养基（C6GCM）共培养，HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量。体内实验，通过侧脑室注射BrdU标记的N-D-BMSCs到大鼠C6胶质瘤模型中，免疫组化分析移植细胞的迁移能力。用ELISA试剂盒检测C6GCM中的VEGF的含量。Transwell小室系统共培养N-D-BMSCs和中和部分VEGF因子的C6GCM共培养，HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量。明胶酶谱实验检测BMSCs培养基中的MMP活性。结果：在体外实验表明N-D-BMSCs对C6胶质瘤条件培养基有显著趋向（P<0.01）；体内移植结果显示BrdU阳性细胞明显向肿瘤部位迁移并呈现时间特异性；C6GCM中含有VEGF；并且VEGF减少的GCM对N-D-BMSCs吸引减弱。N-D-BMSCs培养基中的含有MMP。结论：无论在体外还是体内，N-D-BMSCs对C6胶质瘤皆具有明显的趋向性；初步证实了VEGF是N-D-BMSCs对C6胶质瘤细胞趋向性机制中的重要因子，MMP可能参与了N-D-BMSCs向C6胶质瘤细胞的迁移。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 第一部分 骨髓间充质干细胞成神经细胞分化
• 1 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 BMSCs 的分离培养鉴定
• 2.2 BMSCs 成神经细胞分化
• 2.3 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 BMSCs 的形态学特点
• 3.2 BMSCs 的鉴定
• 3.3 BMSCs 分化过程中的形态学变化
• 3.4 BMSCs 分化后鉴定
• 4 讨论
• 第二部分 成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞对 C6 胶质瘤趋向性的研究
• 1 材料
• 1.1 实验动物和细胞系
• 1.2 主要试剂和仪器
• 2 方法
• 2.1 BMSCs 的分离培养分化
• 2.2 Transwell 系统检测 N-D-BMSCs 对 C6 胶质瘤细胞培养基的趋向性
• 2.3 N-D-BMSCs 在体内对 C6 胶质瘤的趋向性
• 2.4 检测 C6 胶质瘤细胞培养基的 VEGF
• 2.5 VEGF 对 N-D-BMSCs 向 C6 胶质瘤细胞培养基趋向性的影响
• 2.6 N-D-BMSCs 的培养基中 MMP 测定
• 2.7 统计学分析
• 3 结果
• 3.1 N-D-BMSCs 对 C6 胶质瘤细胞培养基有明显趋向性
• 3.2 N-D-BMSCs 对 C6 胶质瘤有明显趋向性
• 3.3 VEGF 有助于 N-D-BMSCs 向 C6 胶质瘤细胞培养基趋向
• 3.4 N-D-BMSCs 培养基中含有 MMP-2
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢