木糖产乙醇酵母的筛选及分子生物学改造

论文摘要

随着能源危机的日益加剧,化石燃料日益减少,国际原油价格不断上涨。以纤维质原料生产燃料乙醇是目前国内外的研究热点之一。其研究关键之一就是选育一株能有效利用各种糖底物,且高效产生乙醇的微生物菌种。本论文以此为研究点,采用代谢工程育种策略,以筛选得到的野生型热带假丝酵母为研究对象,通过改变其代谢流来达到提高乙醇产量的目的。从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D-木糖的酵母441-28-1。根据常规形态鉴别,生理生化实验测定,以及ITS区域核酸序列同源性比较分析,证实该菌株属于Candida tropicali（s热带假丝酵母）,其ITS序列在GenBank的登记号为EU121523,Candida tropicalis（热带假丝酵母）已保存于中国高校工业微生物资源数据平台,保藏编号为CICIM Y0092。以筛选出来的热带假丝酵母为研究对象,通过代谢产物分析发现该酵母木糖代谢的主要产物为木糖醇,葡萄糖代谢的主要产物为乙醇。通过分析酵母的代谢途径并测定木糖代谢途径中的两个关键酶的比酶活力后,并结合文献报道,确定了代谢工程育种策略为:通过增加细胞内木糖醇脱氢酶的表达量,来减少木糖醇的积累,试图将代谢流引向乙醇形成方向,以达到提高乙醇产量的目的。以本实验室先期构建的pXY212-XYL2质粒为基础载体,构建了含有潮霉素抗性的质粒pYX212-XYL2-hygro（该质粒用于整合表达时,需先用限制性内切酶Not I先将其线性化）,电击转化进入酵母,潮霉素抗性平板上筛选得到转化子。提取整合表达的重组菌染色体进行PCR验证,得到1.7kb的树干毕赤酵母XYL2基因,说明该基因已整合到酵母染色体上。酶活测定后,发现游离表达的重组菌的比酶活力达到0.5 u/mg,比原始菌株提高了3倍;而整合表达的重组菌的比酶活力仅提高了15%,提高幅度有限。木糖发酵实验发现,游离表达的重组菌株与原始菌株相比,木糖醇得率降低了3倍,乙醇得率提高了5倍;整合表达的重组菌株与原始菌株相比,乙醇得率没有发生明显的变化,但木糖醇积累量有所降低,这与目的基因表达量有关。发酵实验表明,提高木糖醇脱氢酶的表达量,有助于减少中间代谢产物木糖醇的积累,提高乙醇得率。通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性,这对研究酵母利用纤维质原料生产燃料乙醇具有重要启示。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 发展燃料乙醇的意义
• 1.1.1 燃料乙醇工业的发展前景
• 1.1.2 我国燃料乙醇的生产现状
• 1.2 纤维质及其利用的研究现状
• 1.3 微生物木糖代谢途径
• 1.4 发酵木糖生产乙醇的菌种自然筛选
• 1.4.1 细菌发酵木糖
• 1.4.2 真菌发酵木糖
• 1.4.3 酵母菌发酵木糖
• 1.5 基因工程菌的构建
• 1.5.1 天然底物利用策略
• 1.5.2 重组菌底物利用策略
• 1.6 立题意义
• 1.7 研究内容
• 第二章 高效利用木糖的酵母菌株的筛选与鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 样品来源
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 酵母菌染色体提取试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 采样与分离
• 2.2.2 TTC 平板初筛
• 2.2.3 酵母复筛
• 2.2.4 分析方法
• 2.2.5 分类鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 酵母菌的分离筛选
• 2.3.2 TTC 平板初筛
• 2.3.3 摇瓶复筛
• 2.3.4 分类鉴定
• 2.4 本章小结
• 第三章 Candida tropicalis CICIM Y0092发酵特性分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 培养基
• 3.2 方法
• 3.2.1 代谢产物分析
• 3.2.2 木糖代谢途径中关键酶比酶活力测定
• 3.2.3 菌株生长曲线的测定
• 3.2.4 木糖发酵实验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 木糖代谢产物分析
• 3.3.2 葡萄糖代谢产物分析
• 3.3.3 木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）比酶活测定
• 3.3.4 C. tropicalis CICIM Y0092 生长曲线
• 3.3.5 C. tropicalis CICIM Y0092 木糖发酵试验
• 3.4 本章小结
• 第四章 代谢工程改善Candida tropicalis木糖代谢产乙醇的性能
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 培养基、工具酶和试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 酵母对潮霉素敏感性测定
• 4.2.2 质粒的大量提取
• 4.2.3 大肠杆菌E. coli 感受态的制备及简易转化程序
• 4.2.4 质粒小提
• 4.2.5 热带假丝酵母电击转化法
• 4.2.6 酵母染色体的提取
• 4.2.7 细胞裂解液的制备
• 4.2.8 酶活的测定
• 4.2.9 发酵方法
• 4.2.10 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 潮霉素敏感性实验
• 4.3.2 质粒的构建
• 4.3.3 质粒的酶切验证
• 4.3.4 热带假丝电击转化
• 4.3.5 转化子的验证
• 4.3.6 木糖发酵实验
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 1. 主要结论
• 2. 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者攻读硕士学位期间发表论文
• 附录2： ITS 序列测序图