论文摘要
原发性肝癌（Primary Hepatic Carcinoma,PHC）是恶性程度高、预后极差的恶性肿瘤之一,其中90%是肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,在全球癌症死亡人口中列第三大死因。多数患者就诊时已处于晚期,一般自诊断之日起中位生存时间＜12个月。在我国,每年约有11万人死于肝癌,居恶性肿瘤病死亡率的第三位。全球每年新发肝癌约26万例,且发病率有上升的趋势,其中我国占一半以上。尽管肝癌的诊断和治疗水平在不断提高,但肝癌的发病率和死亡率仍居高不下,因此肝癌的防治研究是一个非常有重要意义的课题。当今抗肝癌研究热点很多,主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤免疫逃逸等的免疫研究、抑制肿瘤新生血管生长等的靶向研究和提高生存质量等方面,很多抗肿瘤药物都是从以上方面进行研发的。中医药的积极参与是推动我国肝癌防治研究、提高肝癌临床疗效的特色所在。中医药辨证施治研究、复方配伍研究以及从中药中提取有效成份研究等都已在实验和临床中广泛开展。研究表明,中医药在减少肝癌复发转移,减轻放、化疗副作用,提高机体免疫以及改善肝癌患者生活质量、延长生存时间等方面都显示了一定的优势,成为肝癌治疗的重要手段。目前从中草药中寻找抗肿瘤有效成分,运用现代科学技术,阐明药物疗效的物质基础和作用机理,加以开发研究已成为肿瘤防治领域的热点课题。国内外研究表明,青蒿琥酯有较好的抗肝癌效果,能杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,但缺少系统研究,因此,还需要加强青蒿琥酯的抗肝癌作用及其机理研究。青蒿琥酯是一个多靶点,多作用机制的药物,青蒿琥酯抗肝癌作用可能与多种作用机制有关,进一步探讨了青蒿琥酯对小鼠肝癌的抑制作用,研究其作用机制对于开发青蒿素及其衍生物的临床新用途有重要意义。目的观察不同剂量青蒿琥酯对H22肝癌小鼠肿瘤生长的抑制作用,探讨青蒿琥酯的抑瘤作用与细胞凋亡、肿瘤组织VEGF、FasL的表达和机体免疫的可能关系,进一步揭示青蒿琥酯抑制肝癌的可能机制。方法采用H22小鼠肝癌细胞株皮下移植法建立荷瘤NIH小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为环磷酰胺组（CTX）、青蒿琥酯各剂量组（15mg/kg组、30mg/kg组、45mg/kg组、60mg/kg组）和模型对照组（Model）。腹腔给药:CTX 20mg/kg,隔日一次,另一日以生理盐水代替;青蒿琥酯各剂量（15mg/kg、30mg/kg、45mg/kg、60mg/kg）,每日一次;模型对照组仅予等量生理盐水,每日一次,并设立正常对照组,共给药15d。观察各组小鼠的一般情况,比较生存时间;测量肿瘤大小,计算肿瘤体积、肿瘤称重计算抑瘤率;TUNEL技术检测治疗后肿瘤细胞凋亡情况;免疫组化法观察肿瘤组织VEGF和FasL表达情况;流式细胞术检测小鼠外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和NK细胞百分比,检测小鼠机体免疫功能。结果1.1小鼠一般情况和生存时间采用H22小鼠肝癌细胞株皮下移植法建立荷瘤NIH小鼠模型成功率100%。模型对照组从第3天始,其它荷瘤组从第5天开始,在皮下注射部位可触及肿瘤。肿瘤生长迅速,质地逐渐变硬。各组小鼠肿瘤大小不一;随着肿瘤的增大,小鼠逐渐出现状态欠佳,进食进水量减少,活动减少,皮毛失去光泽,消瘦;第16天开始,出现荷瘤小鼠死亡,其中模型对照组小鼠死亡速度最快。青蒿琥酯各剂量组小鼠未观察到明显毒性反应。各组小鼠平均生存时间比较:模型对照组为20.30±3.95天;ATS 30mg/kg、ATS 45mg/kg剂量组和CTX组分别为27.90±7.96天、28.60±6.36天和26.30±5.17天,长于模型对照组（P＜0.05,P＜0.01）;ATS 30mg/kg、ATS 45mg/kg剂量组长于ATS 15mg/kg组（P=0.04和P=0.02）;而ATS 60mg/kg、ATS 15mg/kg组与模型对照组比较无差异（P＞0.05）。生命延长率比较,ATS 45mg/kg组为40.89%,ATS 30mg/kg组为37.44%,高于CTX组的29.56%。1.2肿瘤体积、肿瘤质量和抑瘤率用药结束后,各治疗组肿瘤体积小于模型对照组（P＜0.05,P＜0.01）;组间比较,ATS 45mg/kg组肿瘤体积小于ATS 15mg/kg组（P=0.003）;ATS 45mg/kg组与ATS 30mg/kg组、ATS 60mg/kg组肿瘤体积无差别（P＞0.05）,ATS 45mg/kg组与CTX组比较,无差异（P=0.29）。模型对照组小鼠肿瘤质量为2.35±0.16g,高于各治疗组（P＜0.01）;治疗组组间比较,ATS 45mg/kg组小鼠的肿瘤质量低于ATS 15mg/kg组和ATS 60mg/kg组（P=0.000,P=0.037）;ATS 45mg/kg组小鼠的肿瘤质量与ATS 30mg/kg剂量效果相当（P=0.269）;CTX组与ATS 45mg/kg组的肿瘤质量相差不大（P=0.428）,与ATS 30mg/kg剂量组比较无差异（P=0.06）。抑瘤率比较:CTX组、ATS 45mg/kg、ATS 30mg/kg组抑瘤率无显著性差异（P＞0.05）,而高于ATS 15mg/kg、ATS 60mg/kg剂量组。1.3肿瘤细胞凋亡指数与模型对照组比较,青蒿琥酯各剂量组和CTX组小鼠的细胞凋亡指数都有不同程度的升高（P＜0.05,P＜0.01）。其中ATS 30mg/kg组和ATS 45mg/kg组比较无显著性差异（P＞0.05）;ATS 30mg/kg组和ATS 45mg/kg组明显高于ATS 15mg/kg组和ATS60mg/kg组（P＜0.05）;ATS 30mg/kg组、ATS 45mg/kg组、CTX组比较无显著差异（P＞0.05）。1.4肿瘤组织VEGF表达各组小鼠肿瘤组织中均出现VEGF阳性表达,模型对照组大部分为强阳性表达,青蒿琥酯各剂量组及CTX组VEGF表达强阳性程度下降,弱阳性上升,经多个独立样本秩和检验:P=0.04,故可认为6组的VEGF表达分级程度上有显著性差异,其中ATS 45mg/kg组下降明显,与模型对照组比较有显著性差异（P＜0.05）,另外CTX也有下调VEGF作用（P＜0.05）,且与ATS 45mg/kg组相似（P＞0.05）。1.5肿瘤组织FasL的表达各组小鼠肿瘤组织FasL均表达阳性,模型对照组表达阳性分级程度较高,青蒿琥酯各剂量组相对较低,各组间两两比较,ATS 45mg/kg剂量组小鼠肿瘤组织FasL的表达低于模型对照组和CTX组（P＜0.05）。1.6小鼠外周血淋巴细胞亚群模型对照组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比低于正常对照组（P＜0.01）,CD8+与正常组比较差异无统计学意义,CD4+/CD8+低于正常对照组（P＜0.05）。与模型对照组比较,ATS 30mg/kg、ATS 45mg/kg剂量组能提高荷瘤小鼠CD3+和CD4+T淋巴细胞百分比（P＜0.05,P＜0.01）;CD8+比较无统计学差异,CD4+/CD8+比值高于模型对照组（P＜0.01）。ATS 15mg/kg、ATS 60mg/kg剂量组CD4+/CD8+比值与模型对照组比较无差异（P＞0.05）。与CTX组比较,ATS 30mg/kg、ATS 45mg/kg剂量组的CD3+、CD4+、CD8+无差异（P＞0.05）,并与正常对照组结果相似（P＞0.05）。1.7小鼠外周血NK细胞百分比模型对照组小鼠NK细胞百分比明显低于正常组（P＜0.05）;CTX组小鼠的NK细胞百分比与模型对照组比较无差异（P＞0.05）;ATS 60mg/kg、ATS 45mg/kg和ATS30mg/kg剂量组明显高于模型对照组（P＜0.05）和CTX组（P＜0.05）,与正常对照组相似（P＞0.05）。结论1.1青蒿琥酯延长荷瘤小鼠的生存时间青蒿琥酯30mg/kg、45mg/kg剂量能延长荷瘤小鼠的生存时间,并且不影响荷瘤小鼠的生存质量。1.2青蒿琥酯抑制H22肝癌小鼠肿瘤的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡青蒿琥酯有一定的抑制H22肝癌小鼠肿瘤生长和诱导细胞凋亡作用,其中,青蒿琥酯45mg/kg和30mg/kg是抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长的较好剂量。1.3青蒿琥酯能下调H22肝癌小鼠肿瘤组织VEGF、FasL的表达青蒿琥酯45mg/kg剂量能下调肿瘤组织VEGF的表达,从而抑制肿瘤新生血管形成,抑制肝癌的转移浸润和复发;青蒿琥酯45mg/kg剂量能下调肿瘤组织FasL的表达,从而减少因肿瘤组织表达FasL引起的肿瘤免疫逃逸,使机体免疫更好地发挥抗肿瘤效应。1.4青蒿琥酯能增强H22肝癌小鼠的机体免疫功能青蒿琥酯45mg/kg和30mg/kg剂量能提高荷瘤小鼠外周血的CD3+和CD4+T淋巴细胞百分比,增强机体细胞免疫;青蒿琥酯60mg/kg、45mg/kg和30mg/kg剂量可以提高NK细胞百分比,增强NK细胞的活性。提示青蒿琥酯能增强荷瘤小鼠的机体免疫力,恢复机体免疫抗肿瘤效应。1.5青蒿琥酯30mg/kg、45mg/kg剂量是一个较好的抗肝癌剂量,其中青蒿琥酯45mg/kg剂量在抑制VEGF和FasL的表达上作用更佳。综上所述,本研究通过体内实验,以H22小鼠肝癌皮下移植瘤模型,观察了不同剂量青蒿琥酯对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用,并从多个研究热点中探讨了青蒿琥酯的作用机制,为进一步开发青蒿琥酯的抗肝癌方面的应用作了较系统的研究。
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