雌激素调控的由ox-LDL介导树突状细胞免疫成熟在动脉粥样硬化中作用机制的研究

论文摘要

冠心病（coronary heart disease,CHD）是当今严重危害人类健康最主要的疾病之一。目前CHD的发病机制尚不十分清楚,研究与其相关的危险因素尤为重要。现已知传统的危险因素大体上可以分为遗传因素（如心脏病家族史、性别、年龄等）和环境因素（如吸烟、血脂异常、高血压、体育锻炼等）,近年来发现代谢因素如高同型半胱氨酸血症,感染因素如肺炎衣原体,幽门螺旋杆菌、巨细胞病毒等,以及多种参与免疫反应的细胞和分子也与CHD有着重要的关系。因此近年人们又提出CHD的发生发展机制与炎症和免疫反应有关。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是CHD的病理基础,炎症和免疫作为内在和外在的危险因素,是致AS发病的中介和中心环节,其中T淋巴细胞所引起的一系列特异性免疫反应在AS的发生发展中起重要作用。T淋巴细胞的活化依赖于T细胞受体与抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC）表面MHC分子呈递的抗原之间的相互作用。DC是目前已知功能最强大的、唯一能激活初始型T细胞的APC,在免疫反应中起重要作用。当DC遇到外来病原体时,将抗原递呈给T细胞,使其活化增殖,分泌细胞因子,启动免疫反应。研究发现,动脉壁中有DC的存在,且在AS斑块中明显增加,尤其在炎症浸润区域与T淋巴细胞高度聚集。多种公认的致AS危险因素都可促使DC免疫功能成熟,提示DC在AS的发生发展中可能起着重要作用。其中,ox-LDL是引起AS免疫活化重要的自身抗原,可引起血管内皮功能失调、参与泡沫细胞形成、促进血管平滑肌细胞增殖及诱导凋亡等,促进人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）源DC的分化成熟从而启动免疫反应。ox-LDL的致AS程度不仅决定于其自身水平,还取决于其受体及受体后效应的变化。经典ox-LDL受体是清道夫受体,其主要功能是摄取修饰后的LDL。近年来,一种新型的ox-LDL受体凝激素样氧化低密度度脂蛋白受体-1（lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1,LOX-1）被认为是ox-LDL的特异性受体,它主要表达于血管内皮细胞,能特异结合、吞噬、降解ox-LDL,在成熟以及非成熟DC、单核细胞、巨噬细胞、B细胞也均有表达。所以LOX-1表达上调或激活参与了AS发生、发展的多个环节,但是对于ox-LDL诱导LOX-1在DC的表达的研究尚未见报道。众所周知,男性和女性之间的心血管疾病的发病率有显著的差异,这除了与遗传和生活方式有关外,还有可能是女性内源性雌激素有抗AS作用,已经发现雌激素替代疗法可降低心血管疾病的危害性。雌激素对免疫系统的影响也颇受研究者的瞩目,研究表明,雌激素的替代疗法可治疗某些自身免疫性疾病,提示雌激素在免疫系统的维持和调节方面可能起着一定的作用。关于雌激素对DC影响的研究在其他疾病的研究中取得了令人满意的结果,但关于AS方面的研究未见报道。鉴于上述证据,我们可以以CHD发生的炎症和免疫学机制为基础,研究经典危险因素中性别因素与免疫反应之间的关系,假设雌激素通过抑制AS发展的免疫反应对心血管系统发挥保护作用。因此,为进一步明确雌激素对心血管免疫保护作用的机制,本课题通过研究雌激素与AS发生发展的免疫机制,探讨雌激素对ox-LDL及其受体介导的DC成熟及功能的影响,阐明CHD新的发病机制,进而拓展CHD的诊疗手段。本课题分为两个部分,第一部分:通过ELISA、直接化学发光免疫技术及流式细胞技术检测绝经后女性急性冠脉综合症（acute coronary syndrome,ACS）患者外周血hs-CRP、IFN-γ、IL-10、雌二醇（estradiol,E2）水平、DC前体各亚群分布情况,与胸痛综合症（chest pain syndrome,CPS）及健康对照组进行比较,并且进行相关性分析来探讨CHD危险因素中性别因素与机体免疫反应的始动者DC之间的关系,研究性激素能否通过免疫反应这一环节对AS的发生、发展产生保护作用。第二部分:将人PBMC来源的DC作为实验模型,以ox-LDL作为抗原诱导DC成熟,用流式细胞技术、RT-PCR、Western blotting和ELISA等方法,观察DC的成熟程度、DC刺激T淋巴细胞使T淋巴细胞增殖和分泌细胞因子的能力以及ox-LDL受体LOX-1 mRNA和蛋白在DC的表达,并进一步应用17β-E2进行干预研究。本课题通过研究雌激素对心血管系统保护作用的免疫学机制,旨在为AS发生发展的免疫介导学说提供实验依据,为CHD的防治提供新的理论平台和技术手段,具有深远的意义。结果分述如下:1绝经后女性ACS患者E2水平与DC亚群变化具有相关性1.1入选各组病例一般临床资料比较无显著性差异临床入选病例共82例,其中CHD组（SA、UA组和AMI组）62例、CPS组10例、健康对照组10例,以上各组及CHD组内一般临床资料的比较无显著性差异,具有可比性。1.2 ACS患者外周血清E2水平及E2/T降低用直接化学发光免疫技术检测CHD组（SA、UA组和AMI组）E2水平及E2/T比值均低于健康对照组、CPS组,而且ACS组（UA组和AMI组）E2水平及E2/T比值均低于SA组,而CHD组（SA、UA组和AMI组）T水平高于健康对照组、CPS组,说明CHD患者E2水平减低,E2与T之间水平失衡,以E2下降为主。1.3 ACS组患者外周血DC亚群比例及数量降低流式细胞术检测CHD组（UA组、AMI组和SA组）外周血的mDC占PBMC比例和计算所得mDC实际数量以及mDC/pDC均低于健康对照组、CPS组,而且ACS组（UA组和AMI组）均低于SA组;各组pDC占PBMC比例和计算所得实际数量没有显著性差异,说明CHD患者外周血mDC减少,而且与pDC之间平衡发生变化,呈现出以mDC减少为主的趋势。1.4 ACS组患者外周血E2与外周血DC亚群比例相关ACS组外周血E2水平与外周血mDC所占PBMC比例呈正相关,与pDC无相关性;T与mDC所占PBMC比例无相关性。1.5各组患者外周血hs-CRP、IFN-γ和IL-10水平检测ACS组（UA组和AMI组）外周血hs-CRP和IFN-γ水平高于健康对照组、CPS组和SA组;IL-10水平在各组间比较没有差异,但是ACS组（UA组和AMI组）IFN-γ/IL-10比值比健康对照组、CPS组和SA组高,说明ACS患者体内存在着炎症反应和免疫活化,并且以IFN-γ升高占优势。2 ox-LDL及其受体LOX-1介导PBMC源DC免疫成熟及雌激素的干预作用将加ox-LDL分为5组（均n=8）:（1）对照组:DC+PBS;（2）DC+LDL（25mg/L）组;（3）DC+ox-LDL（25mg╱L）组;（4）DC+ox-LDL（50mg╱L）组;（5）DC+ox-LDL（100mg/L）组。加17β-estradiol（17β-E2）预处理时分为5组（均n=8）:（1）对照组（DC+PBS）;（2）DC+ox-LDL（50 mg/L）组;（3）DC+17β-E2(10-7mol/L)+ox-LDL（50mg/L）组;（4）DC+17β-E2(10-8mol/L)+ox-LDL（50mg/L）组;（5）DC+17β-E2(10-8mol/L)+ox-LDL（50 mg/L）组。2.1 DC的镜下鉴定:倒置相差显微镜及扫描电镜下,从外周血中分离的PBMC经ox-LDL诱导成为细胞形态不规则、表面毛刺状突起、细胞质丰富的DC。2.2对DC表型的影响2.2.1 ox-LDL上调DC表型的表达流式细胞仪检测人外周血PBMC来源的DC表型CD1a,CD80,CD83,CD86及HLA-DR。ox-LDL组CD1a、CD86和HLA-DR表型表达高,说明ox-LDL可刺激外周血PBMC来源的DC成熟,且随ox-LDL浓度增高DC成熟度亦增高。2.2.2 17β-E2下调ox-LDL诱导成熟的DC表型的表达预先加17β-E2的DC表面CD86和HLA-DR表达低于ox-LDL组,而且具有浓度依赖性,对CD1a没有影响。2.3对DC的同种混合淋巴细胞反应的影响2.3.1 ox-LDL增强DC的同种混合淋巴细胞反应ox-LDL组的DC在与T淋巴细胞1:50及1:20混合时3H-TDR掺入率均高于PBS组和LDL组,而且随着ox-LDL浓度的增加而递增,这说明ox-LDL可能诱导DC成熟并使其处于高度活化状态,而且具有浓度依赖性。2.3.2 17β-E2下调ox-LDL诱导成熟DC的同种混合淋巴细胞反应的影响预先加入17β-E2的DC在与T淋巴细胞1:50及1:20混合时3H-TDR掺入率均低于ox-LDL组,而且3H-TDR掺入率随着17β-E2浓度的增加而减少,表明在17β-E2预先作用下,可以下调ox-LDL诱发DC成熟后的刺激T淋巴细胞增殖的能力,而且具有浓度依赖性。2.4对DC与T淋巴细胞共同培养上清液细胞因子IFN-γ和IL-10水平的影响2.4.1 ox-LDL上调DC与T淋巴细胞共同培养上清液细胞因子IFN-γ的水平ox-LDL组DC与T淋巴细胞共同培养上清液细胞因子IFN-γ水平及IFN-γ/IL-10比值高于PBS组、LDL组,而且具有浓度依赖性,但对IL-10水平没有影响。说明ox-LDL刺激DC免疫成熟后,促进Th1细胞因子IFN-γ分泌,具有促进Th1型免疫反应的能力。2.4.2 17β-E2下调DC与T淋巴细胞共同培养上清液细胞因子IFN-γ水平,上调IL-10水平预先加入17β-E2的ox-LDL诱导成熟的DC与同种T淋巴细胞共同培养上清液分泌的IFN-γ水平低于加ox-LDL组,说明17β-E2可以使ox-LDL诱导成熟的DC刺激T淋巴细分泌IFN-γ减少,具有一定的降低Th1型免疫反应的作用,具有浓度依赖性;大于生理浓度时上调IL-10的分泌,说明17β-E2促进T细胞分泌Th2细胞因子IL-10,具有一定的调控免疫反应向Th2型免疫反应偏移的作用。2.5 RT-PCR检测DC的LOX-1 mRNA表达再增加一组加LOX-1阻断剂组:（6）DC+Polyinosinic acid+Carrageenan（250mg/L）+ox-LDL（50mg/L）组（均n=6）,其余同前。2.5.1 ox-LDL上调DC的LOX-1 mRNA的表达ox-LDL刺激组LOX-1mRNA表达比PBS组、LDL组均高,具有浓度依赖性,加LOX-1阻断剂可使LOX-1 mRNA表达减少,说明ox-LDL可促进LOX-1在DC的mRNA表达,而且ox-LDL可能通过与其受体LOX-1结合发挥效应。2.5.2 17β-E2下调DC的LOX-1 mRNA表达预先加入17β-E2的DC再加入ox-LDL及对照组PBS组LOX-1 mRNA表达低于及于只加ox-LDL组,说明17β-E2可以下调ox-LDL诱导成熟的DC细胞LOX-1受体mRNA表达,而且具有浓度依赖性。2.6 Western blotting检测DC的LOX-1蛋白表达2.6.1 ox-LDL上调DC的LOX-1蛋白的表达ox-LDL刺激组LOX-1蛋白表达比PBS组、LDL组均高,具有浓度依赖性。加LOX-1阻断剂组蛋白表达比未加者均低,具有显著性差异。说明ox-LDL可促进LOX-1在DC蛋白的表达,而且ox-LDL通过与其受体LOX-1结合发挥效应,其结合程度呈剂量依赖性。2.6.2 17β-E2下调DC的LOX-1蛋白的表达预先加入17β-E2的DC再加入ox-LDL,其LOX-1蛋白表达低于只加ox-LDL组,说明17β-E2可以下调ox-LDL诱导激成熟的DC细胞LOX-1受体蛋白表达,而且具有浓度依赖性。通过上述两个部分的实验,我们能够得出以下结论:①绝经后女性ACS患者外周血E2水平减低,E2与睾酮之间平衡紊乱;②绝经后女性ACS患者DC亚群比例及绝对数量发生变化,体内DC处于活化状态;③绝经后女性ACS患者E2水平与ACS患者外周血DC亚群相关;④绝经后女性ACS患者外周血hs-CRP和细胞因子IFN-γ分泌增多,处于炎症激活状态;⑤ox-LDL可促进DC分化成熟及免疫功能成熟;⑥17β-E2部分下调DC免疫功能成熟;⑦ox-LDL通过与其受体LOX-1结合促进DC免疫成熟,并促进Th1型免疫反应的发生;⑧17β-E2下调ox-LDL所诱导的DC的免疫成熟及LOX-1的mRNA和蛋白的表达,表明17β-E2可能通过抑制ox-LDL与其受体结合发挥心血管保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 绝经后女性急性冠脉综合征患者性激素水平与树突状细胞亚群变化的相关性分析
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 参考文献
• 第二部分 雌激素调控的由ox-LDL介导树突状细胞免疫成熟在动脉粥样硬化中作用机制的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 参考文献
• 结论
• 文献综述
• 附录
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学审稿证明