论文摘要
苯并（a）芘（B[a]P）是一种广泛存在的多环芳烃（PAHs）类环境污染物,主要由含碳物质的高温分解和不完全燃烧产生,它较多的存在于煤烟、香烟的烟雾、熏烤食品、汽车尾气中。肿瘤流行病学调查及实验室研究发现B[a]P具有较强致癌性,它与肿瘤的发生密切相关,尤其与人类肺癌的发生高度有关。2006年,B[a]P已被世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）从第二类A组“很可能对人类致癌物”改为第一类“人类致癌物”。BaP是间接致癌物,需在体内代谢生成活性代谢终产物才具有强烈的致癌作用。BaP代谢过程复杂,可产生20多种氧化代谢产物和大量结合物,如环氧化物、酚、醌、二醇、二氢二醇、二醇环氧化物和四醇等。其中以反式二氢二醇环氧苯并（a）芘[anti-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo（a）pyrene, anti-BPDE]致癌活性最强。anti-BPDE具有亲电子性,易与蛋白质和核酸大分子反应,特别易于与嘌呤残基反应。它通过攻击DNA亲核位点与其共价结合形成BPDE-DNA加合物,引起DNA碱基突变,从而使癌基因和/或抑癌基因表达或功能改变,另外它还可以与蛋白质及转录因子结合,影响细胞的代谢及细胞周期的正常进行,引起细胞发生恶性转化。尽管国内外专家学者对BaP的致癌进行了很多研究,但其分子机制仍不十分清楚。因此,本研究从文献中搜索与人类肺癌高度相关的原癌基因,并检测它们在反式BPDE恶性转化细胞中的基因转录及翻译水平上表达变化→应用RNA干扰技术抑制癌基因HER2/neu表达→抑制HER2/neu基因表达对反式BPDE恶性转化细胞生物学特性的影响进行研究,为探索环境污染物B（a）P的致癌分子机制提供一定依据,为肿瘤的基因预防、早期诊断及治疗提供理论与技术基础。现将结果报告如下:第一部分反式二羟环氧苯并（a）芘主要相关原癌基因表达研究目的:苯并（a）芘（B[a]P）作为广泛存在的一种典型的多环芳烃类环境污染物,研究证明它具有致癌性,与人类肺癌发生密切相关。反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘（反式-BPDE）是B[a]P体内代谢的终致癌产物,尽管已进行过一些研究,但其致癌的分子机制特别是相关原癌基因的研究仍不十分清楚,本研究通过文献检索发现在人类肺癌中高表达的原癌基因,通过QRT-PCR和Western blot技术检测这些原癌基因在反式-BPDE诱导转化16HBE细胞中表达变化,为其致癌的分子机制研究及生物学标志的筛选提供一定资料。方法:通过国内外文献检索分析与人类肺癌高度相关的表达增高的4条原癌基因,找出可能与环境污染物苯并（a）芘密切相关的癌基因。分别提取反式BPDE恶性转化16HBE细胞（16HBE-T）与溶剂DMSO对照组细胞（16HBE-N）的总RNA和总蛋白,应用逆转录荧光定量PCR方法和Western blot的方法,分别检测HER2/neu, c-myc, cyclin D1和K-ras癌基因相应mRNA和蛋白表达水平,并用细胞免疫化学方法验证蛋白表达水平改变及检测各蛋白表达定位。结果:RT-PCR和QRT-PCR试验结果均显示16HBE-T与16HBE-N两组间HER2/neu、c-myc、cyclin D1、K-ras癌基因表达在转录水平存在有差异。再经蛋白水平检测分析验证,发现在BPDE转化细胞中这些癌基因亦存在蛋白水平高表达,免疫细胞化学技术分析蛋白表达定位无异常变化。结论:初步筛选了在反式BPDE恶性转化16HBE细胞中表达增高的原癌基因,发现这些原癌基因激活可能是反式BPDE致癌分子机制之一。为进一步研究环境污染物苯并（a）芘导致人类肺癌发生提供一些基础的资料。第二部分抑制反式二羟环氧苯并（a）芘高表达原癌基因HER2/neu的研究目的:HER2/neu基因是在第一部分研究的基础上,确认出的与反式BPDE诱导16HBE恶变细胞有关的重要的高表达原癌基因。虽然在其他一些肿瘤细胞中对HER2/neu基因已进行了一些研究,但其在BPDE致癌机制中所起的作用却不清楚。本部分是为了探讨HER2/neu基因在反式BPDE恶性转化细胞及其致癌机制中的作用,应用RNA干扰技术建立较稳定的特异性抑制反式BPDE恶性转化细胞中HER2/neu基因表达的细胞。方法:从GenBank调出HER2/neu基因全长,应用生物信息学知识设计三条RNA干扰的特异性有效靶序列,采用化学合成方法得到HER2/neu小分子干扰RNA （siRNA）,通过脂质体转染介导技术转染16HBE-T细胞,用逆转录荧光定量PCR方法和Western blot技术分析瞬时转染HER2/neu siRNAs后HER2/neu表达抑制水平。筛选出siRNA有效靶序列后,再通过构建pSIREN-RetroQ-neu逆转录病毒表达HER2/neu shRNA载体,转染RetroPackTM PT67细胞后产生的携带HER2/neu shRNA病毒颗粒感染16HBE-T细胞。再经嘌呤霉素培养筛选得到稳定的细胞克隆株。结果:成功应用RNA干扰技术抑制了16HBE-T细胞中HER2/neu基因表达,并构建了HER2/neu shRNA逆转录病毒真核表达载体,利用RetroPackTM PT67包装细胞产生携带HER2/neu shRNA病毒颗粒感染16HBE-T细胞,建立稳定抑制HER2/neu表达的细胞株。结论:筛选了RNA干扰HER2/neu基因表达的特异性有效靶序列,快速建立了HER2/neu shRNA逆转录病毒真核表达载体,并得到了稳定抑制HER2/neu表达的细胞株,为下一步研究探索HER2/neu基因在反式BPDE恶变细胞中的作用奠定基础。第三部分抑制HER2/neu表达对反式二羟环氧苯并（a）芘恶性转化细胞的影响目的:在反式BPDE恶性转化细胞中利用RNA干扰技术建立HER2/neu表达抑制体系的基础上进行基因干扰后细胞生物学特性的研究,并观察对其他相关原癌基因蛋白表达的影响。方法:应用流式细胞技术、MTT方法及软琼脂集落实验分别检测了16HBE-T经RNA干扰前后细胞周期及细胞凋亡、细胞增殖活力及软琼脂集落形成率方面的影响。应用Western blot方法检测了应用两个不同有效靶位点的siRNA干扰抑制HER2/neu表达后的c-myc和cyclin D1蛋白表达的影响。结果:HER2/neu表达抑制的细胞中出现G0/G1期阻滞,并伴随S期细胞周期比例下降。稳定抑制HER2/neu表达细胞株（HBE-T-neu）中细胞增殖活力比干扰对照组细胞HBE-T-N和16HBE-T明显下降。软琼脂集落形成率在HBE-T-neu细胞中有意义的下降。蛋白印迹实验结果表明不同有效靶位点的siRNA抑制HER2/neu表达后伴随有c-myc和cyclin D1蛋白表达的不同程度下降。结论:抑制HER2/neu基因表达可对反式BPDE恶性转化人支气管上皮细胞的恶性表型有一定的逆转作用。推测HER2/neu基因可能在反式二羟环氧苯并（a）芘的致癌机制中起重要作用。
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