米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

论文摘要

纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶,这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。天然微生物产生的纤维素酶活力不够高,生产成本较高。通过基因工程手段,提高纤维素酶的活性是降低纤维素酶生产成本的一个有效途径。根据国际基因库（GenBank Accession No.:D83732.1）中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,序列分析发现该基因无内含子,故直接以提取的米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增得到一条1200bp左右的特异条带,连接到pMD19-T-simple上。测序表明,其长度为1251bp,OFR为1251bp,编码417个氨基酸,5端有一个编码17个氨基酸的信号肽序列,其全长理论分子量为44.46KDa,序列比对发现与参考的内切葡聚糖酶基因序列相似性高达100%。将内切葡聚糖酶基因eg在GenBank中注册,登录号为Accession No. HQ739052。以克隆的内切葡聚糖酶基因eg为基础,将eg定向插入到大肠杆菌表达载体pET32a上,得到重组表达质粒pET32a-eg,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,水解圈筛选结果表明已成功表达。以克隆的内切葡聚糖酶基因eg为基础,将eg定向插入到酵母表达载体pPICZaA上,将pPICZaA-eg线性化后电转化酵母宿主菌X33感受态细胞获得大量阳性转化子,水解圈筛选结果表明己成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65KDa。在摇瓶培养条件下,对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件的优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1L三角瓶诱导培养五天达到最高酶活120U/mL。对原始酶与重组酶的酶学性质比较发现,原始酶的最高酶活可达250U/mL,重组酶的单位酶活力为120U/mL,原始酶的最适pH和温度分别为4.0和55℃,在45℃-65℃和pH3.4-4.4范围内可保持内切葡聚糖酶最高活力80%以上。重组酶的最适pH和温度分别为4.0和45℃,在35℃-45℃和pH3.4-4.4范围范围内可保持内切葡聚糖酶最高活力80%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 纤维素酶研究综述
• 1.1.1 纤维素酶的结构、种类及作用机理
• 1.1.2 纤维素酶的基因克隆
• 1.1.3 纤维素酶的来源
• 1.1.4 纤维素酶的应用
• 1.2 大肠杆菌表达系统研究进展
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统的优点
• 1.2.2 影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素
• 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
• 1.3.1 巴斯德毕赤酵母酵母系统的优点
• 1.3.2 影响外源基因在毕赤酵母系统中表达的因素
• 2 材料
• 2.1 载体与菌株
• 2.2 试剂
• 2.3 培养基
• 2.4 主要仪器
• 2.5 内切葡聚糖酶活力测定溶液
• 2.6 葡萄糖标准曲线的绘制
• 2.7 常用缓冲液
• 2.7.1 缓冲液1×TSS的配制
• 2.7.2 SDS-PAGE电泳缓冲液及试剂
• 3 方法
• 3.1 米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆
• 3.1.2 PCR产物的纯化回收
• 3.1.3 T克隆
• 3.1.4 含eg基因质粒的提取
• 3.1.5 内切葡聚糖酶基因eg的序列分析
• 3.2 内切葡聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 3.2.1 引入酶切位点的eg基因的高保真酶扩增
• 3.2.2 含eg基因质粒的提取
• 3.2.3 含内切葡聚糖酶基因的质粒双酶切
• 3.2.4 回收酶切后的内切葡聚糖酶基因
• 3.2.5 表达载体的准备
• 3.2.6 连接
• 3.2.7 转化
• 3.2.8 阳性菌落鉴定
• 3.2.9 重组表达载体的转化
• 3.2.10 诱导表达
• 3.3 内切葡聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达
• 3.3.1 引入酶切位点的eg基因的克隆
• 3.3.2 含eg基因质粒的提取
• 3.3.3 含内切葡聚糖酶基因的质粒双酶切
• 3.3.4 回收酶切后的内切葡聚糖酶基因
• 3.3.5 表达载体的准备
• 3.3.6 连接
• 3.3.7 转化
• 3.3.8 阳性菌落鉴定
• 3.3.9 毕赤酵母重组表达载体的电击转化
• 3.3.10 高效表达菌株筛选
• 3.3.11 重组酵母表达条件的优化
• 3.3.12 SDS-PAGE
• 3.4 原始酶及重组酶的酶学性质分析
• 3.4.1 原始酶与重酶最适温度的测定
• 3.4.2 原始酶与重组酶温度稳定性的测定
• 3.4.3 原始酶与重组酶最适pH的测定
• 3.4.4 原始酶与重组酶pH稳定性的测定
• 4 结果与分析
• 4.1 内切葡聚糖酶基因eg的克隆、DNA测序和生物信息学分析
• 4.1.1 内气葡聚糖酶eg基因的扩增
• 4.1.2 DNA测序分析
• 4.1.3 生物信息学分析
• 4.2 内切葡聚糖酶基因eg的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 4.2.1 大肠杆菌中表达eg基因的扩增
• 4.2.2 重组表达质粒的构建
• 4.2.3 重组质粒pET32a-eg的鉴定
• 4.2.4 重组质粒的转化及阳性转化子的筛选
• 4.2.5 刚果红平板初筛
• 4.3 内切葡聚糖酶基因eg的克隆及在毕赤酵母中的表达
• 4.3.1 毕赤酵母表达eg基因的扩增
• 4.3.2 酵母重组表达阳性菌的构建
• 4.3.3 重组质粒pPICZαA-eg的鉴定
• 4.3.4 重组质粒电转酵母X33并筛选酶活较高的转化子
• 4.3.5 表达产物的SDS-PAGE分析
• 4.3.6 重组酵母表达条件的优化
• 4.4 原始酶及酵母表达重组酶的酶学性质分析
• 4.4.1 原始酶与重组酶最适温度的测定
• 4.4.2 原始酶与重组酶温度稳定性的测定
• 4.4.3 原始酶与重组酶最适pH的测定
• 4.4.4 原始酶与重组酶pH稳定性的测定
• 5 讨论
• 5.1 大肠杆菌表达研究
• 5.2 毕赤酵母表达研究
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢