论文摘要
昆虫病原真菌是自然界中控制昆虫种群数量重要的微生物类群。同其它病原微生物相比,昆虫病原真菌具有主动侵染的特性,在防治刺吸式口器害虫、鞘翅目害虫以及昆虫的卵、蛹等方面具有独特的优势。但是,目前真菌杀虫剂远不如细菌杀虫剂如Bt（Bacillus thuringiensis）类应用广泛。造成这一局面的主要原因在于真菌杀虫剂对环境因素依赖性强,而且缺乏稳定生物学活性的剂型。加强对昆虫病原真菌致病及逆境适应分子基础研究将有助于高效真菌杀虫剂的研制和应用效果的提高。为了研究昆虫病原真菌致病性与适应性的分子机理,本论文以国内外应用广泛的球孢白僵菌为研究材料,通过农杆菌介导的T-DNA随机插入突变,筛选得到一个表型明显变化的突变体212。利用YADE法克隆得到一个未知功能基因,该基因推测的氨基酸序列与一个功能未知的假定蛋白具有59%同源性,含有一个酸性磷酸酶结构域,其酵母表达产物具有磷酸酶活性。但该基因与已知的磷酸酶基因没有同源性,故命名为BbAPL（Acid phosphatase-like in Beauveria bassiana）。利用同源重组技术将BbAPL破坏后,进一步研究了其在球孢白僵菌中的功能。论文的主要内容如下:1 T-DNA随机插入突变体的获得及相关基因的克隆1.1突变体的获得与特征分析从农杆菌介导的T-DNA随机插入突变库中得到一个具有明显表型变化的突变体212,在Czapek基本培养基上形成的菌落较瘠薄,气生菌丝稀疏,产孢量显著下降等。Southern杂交结果显示,T-DNA在突变体212基因组中为单拷贝插入。利用YADE（Y-shaped adaptor dependent extension）法克隆获得突变体T-DNA的侧翼序列。序列分析结果表明,212的T-DNA插入区域为一个功能未知基因的ORF区域。1.2突变体212相关基因的克隆与序列分析根据突变体212的T-DNA tagging结果设计引物,利用YADE法克隆得到基因的全基因编码序列,利用3′RACE技术克隆得到其cDNA序列。序列分析结果显示,该基因含有一个58 bp的内含子,ORF长为1431 bp,编码476个氨基酸,推测分子量为49.8 kDa,等电点为7.14。该基因的（G+C）含量高达61.5%,具有高表达量蛋白的特征。对编码的氨基酸序列进行功能保守结构域分析发现,该蛋白含有一个磷酸酶结构域,具有组氨酸酸性磷酸酶家族的典型的保守序列RGH,故命名为BbAPL（Acid phosphatase-like in B.bassiana）。NCBI数据库中没有任何已知功能基因与BbAPL同源。克隆得到BbAPL上游序列Papl约1.3 kb。Southern杂交结果显示,BbAPL在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。2 BbAPL表达、定位与磷酸酶活性测定2.1 BbAPL的表达与定位分析将绿色荧光蛋白融合于BbAPL的碳端,融合基因BbAPL::eGFP置于BbAPL的启动子Papl控制之下,利用报告基因进行BbAPL的表达定位分析。结果显示,分生孢子与菌丝内部以及菌丝隔上的荧光较强。由此推测,BbAPL主要分布在分生孢子和菌丝的胞质内以及菌丝的隔上。RT-PCR结果显示,BbAPL在气生菌丝（4d、8d）与分生孢子（14d）中的表达水平没有显著差异,这与含融合报告基因BbAPL::eGFP的转化子荧光观察结果相一致。但在气生菌丝与基内菌丝之间BbAPL的表达有一定的差异。通过冰冻切片观察发现,气生菌丝和分生孢子的荧光要强于基内菌丝,即BbAPL在气生菌丝和分生孢子内的表达水平高于基内菌丝。2.2 BbAPL具有磷酸酶活性将BbAPL在酵母中表达。活性检测结果表明,酵母表达的BbAPL具有磷酸酶活性,可以水解pNPP底物,但不能作用于bis-（p-nitrophenyl）底物,即具有水解磷酸单酯键但不具有水解磷酸二酯键的功能。尽管BbAPL与植酸酶具有相似的活性结构域,但并不具有水解植酸的能力。以pNPP为底物测定的磷酸酶BbAPL的最适pH值为6.0。3 BbAPL的功能研究为进一步明确BbAPL在球孢白僵菌中的功能,采用同源重组策略破坏BbAPL,构建了以bar基因为抗性筛选标记的同源重组载体,通过农杆菌介导的遗传转化导入球孢白僵菌,利用PCR筛选得到4个同源重组突变体RC2、RC53、RC59和RC63。Southern杂交结果显示这4个同源重组突变体中,bar表达元件被插入到BbAPL的ORF中,而且均是单拷贝插入。3.1 BbAPL的缺失不影响球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性BbAPL同源重组突变体在高温和高渗条件下的生长速率以及分生孢子对逆境的抗性与野生菌株没有显著差异。3.2 BbAPL缺失导致菌落生长瘠薄,生物量和产孢量显著下降菌落形态观察结果表明,在基本培养基（Czapek）上同源重组突变体的气生菌丝比野生菌株瘠薄。同源重组突变体的积累的生物量只有野生菌株和异位转化子的1/3左右。在固体Czapek培养基上,不同菌株之间的产孢量也有很大差异,同源重组突变体的产孢量显著低于野生菌株,不到野生菌株和异位转化子产孢量的50%。推测BbAPL的缺失造成产孢量的下降可能与菌落气生菌丝较瘠薄有关。3.3 BbAPL的缺失影响气生菌丝的形成和发育及分生孢子和气生菌丝的疏水性和附着性对菌落显微观察,结果显示,同源重组突变体的气生菌丝较野生菌株和异位转化子稀疏。进一步研究发现,同源重组突变体菌丝对培养基的穿透和气生菌丝的形成都比野生菌株和异位转化子滞后。表明BbAPL的缺失影响了球孢白僵菌气生菌丝的形成与发育。这也可能是出现菌落瘠薄的表型的原因之一。丝状真菌气生菌丝的形成过程与其疏水性有密切关系。对不同菌株气生菌丝疏水性检测结果表明,同源重组突变体的气生菌丝的疏水性显著下降。用（亲水/疏水）两相分布法检测各菌株分生孢子的疏水性。测定结果显示,同源重组突变体的分生孢子的疏水性比野生菌株下降约16-20%。分生孢子与菌丝对疏水表面的附着性也出现一定程度的降低,分别下降了约8%和13%。3.4 BbAPL缺失促进气生菌丝之间的融合在基本培养基Czapek上生长,同源重组突变体的气生菌丝之间形成大量短的菌丝桥并相互融合。推测该现象可能与气生菌丝疏水性下降有关。3.5 BbAPL影响菌株对无机磷敏感性与野生菌株相比,在含有高浓度无机磷（K2HPO4）的培养基上同源重组突变体气生菌丝生长受到显著抑制,但在低浓度无机磷条件下,其气生菌丝生长与野生菌株没有明显差异。推测BbAPL可能与无机磷的吸收利用有关。3.6 BbAPL对菌株毒力的影响以桃蚜成虫为试虫进行生物测定。结果显示,在1×108个孢子/ml浓度下,接种168h野生菌株与同源重组突变体对桃蚜的累计死亡率没有显著差异。而接种后用0.05%Tween-80进行喷雾洗涤,同源重组突变体对桃蚜的累计死亡率（59-63%）显著低于野生菌株（70%）（野生菌株）。该结果也进一步表明,BbAPL可能与球孢白僵菌分生孢子在昆虫体壁的附着有关。