论文摘要
结核病（tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球有1／3的人口感染过MTB，每年有800万新感染患者和300万患者死亡，表明TB仍是影响全球人类健康的一个主要公共卫生问题。近年来，由于预防疫苗卡介苗（Bacillus Calmette Guerin, BCG）保护性不完善、耐药MTB流行、与人类免疫缺陷病毒（Human immunodificiciency Virus, HIV）的协同感染以及人口流动等原因使TB疫情日益严重。结核病现临床常用的诊断筛选方法是用纯化的结核菌素蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin,PPD）进行的皮肤试验，但是PPD是一种成分复杂的蛋白混合物，除了含有牛分支杆菌特异性分泌抗原外，还含有许多其他分支杆菌具有的类属抗原，因此交叉反应无法避免，而且早期感染抗体水平较低，使诊断试剂特异性不高，TB病例的及时发现成为难题。鉴于以上问题，TB新型疫苗或增强BCG免疫效果以及特异、快速诊断试剂的研究具有重要意义。MTB的保护性抗原存在于其短期培养物滤液（ST-CF）中。ST-CF主要是由MTB在生长过程中产生的分泌性分子及胞内释放出的某些分子组成，含有200多种多肽。其中早期分泌性抗原靶6（early secretory antigen target6, ESAT-6）是MTB感染早期介导细胞免疫应答的主要优势抗原，可被感染了结核杆菌的动物或病人有免疫活性的T淋巴细胞所识别，并产生高水平的IFN-γ，IFN-γ可显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内MTB的生长抑制作用和杀伤能力。ESAT-6蛋白仅存于致病的MTB中，在各种BCG菌株中均缺失。本研究通过PCR从MTB H37Rv株基因组中扩增出编码ESAT-6蛋白的基因，构建了pGEX-4T-1-ESAT-6原核表达载体，经Western-Blot检测表明成功表达该蛋白。表达蛋白以包涵体形式表达。以两种方式回收目的蛋白，一种是通过研磨SDS-PAGE凝胶表达带收集匀浆上清液。另一种是通过包涵体变性、复性、Sephadex G-200凝胶过滤层析获得ESAT-6蛋白。在上述研究基础上，本试验还初步研究了ESAT-6蛋白的免疫学活性。采用皮下注射的方法，用预先通过两种方式收集的表达蛋白免疫小鼠，同时设BCG免疫阳性和空白组。免疫完成后，通过琼脂扩散法检测免疫小鼠血清中特异性的抗ESAT-6抗体，最高滴度达到为1：64。并且通过MTT法检测淋巴细胞非特异性和特异性增殖反应，分离小鼠的脾淋巴细胞，正常鼠用ConA和ESAT-6刺激，刺激指数分别为2.54和1.93，说明该蛋白具有直接刺激T细胞免疫的活性。免疫鼠用特异性抗原PPD，ESAT-6蛋白（SDS-PAGE回收、SephadexG-200回收）刺激，刺激指数分别为2.27、1.68和1.87。ESAT-6蛋白免疫组实验结果均低于BCG组，说明单一蛋白免疫效果与BCG相比仍有很大差距。由于ESAT-6蛋白在各种BCG菌株中缺失，而且在结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌中同源性达到100％，许多研究已经证实是非常有前景的鉴别诊断候选抗原。本研究采用该抗原建立结核病的间接ELISA检测方法，旨在为临床结核病的诊断提供一种特异性，敏感性和实用性都比较理想的诊断试剂。首先是建立结核特异性抗体ELISA检测方法，本研究在前人工作的基础上对抗原包被浓度和血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定等方面作了摸索和改进。改进后的ELISA阴性背景降低，血清稀释液简化，结果判定更为科学。其次是应用结核特异性抗体ELISA检测方法进行临床试验，通过对来自不同地区的1000份临床样品的检测，及用PPD抗原和ESAT-6抗原同时包被，比较两者的检测结果。结果表明两者检测的结果存在着一定的差异。说明该ELISA方法和该抗原在结核病的早期诊断和适时监测具有很大的发展前景。综上所述，本研究通过分子生物学技术表达MTB分泌性ESAT-6蛋白。重组蛋白免疫小鼠后，可在小鼠体内引发保护性免疫反应，表明该蛋白可作为MTB疫苗的候选组分。结核特异性抗体ELISA检测方法用于结核病的检测具有重复性好，敏感性高，特异性强等优点，可望开发成诊断试剂盒。