1型鸭肝炎病毒JX株基因组序列分析及VP0、VP1基因的原核表达

论文摘要

随着水禽养殖业的快速发展,鸭病越来越受到重视,其中鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的一种主要传染病。有关DHV-1的分子生物学相关研究进展缓慢,其基因组结构和蛋白组成只是预测并且还存在差异,对病毒蛋白的功能研究国内外还未见报道。本研究通过对DHV-1 JX株进行基因组序列的测定与分析,并对其编码结构蛋白的VP0和VP1基因进行原核表达和免疫活性检测,希望为DHV-1的诊断、分子流行病学研究和疫苗的研制提供科学依据。本研究主要完成了以下研究工作:（1）根据GenBank上已发表的DHV-1基因组序列设计9对互相重叠的特异性引物,以JX株RNA为模板,RT-PCR扩增不同的目的基因,分别克隆到pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,对阳性克隆进行测序,最后拼接出JX株基因组的核苷酸序列,得到7582bp核苷酸序列,并将JX株基因组序列提交到GenBank,登录号为:EF093502。基因组序列包括5’-UTR的部分序列、3’-UTR的部分序列和一个的ORF（长6750bp,编码一个含有2249个氨基酸的多聚蛋白）。基因组结构为:5’UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3’UTR。（2）运用DNA Star软件,对JX株基因组序列与GenBank上已发表的其他不同DHV-1毒株的基因组序列进行同源性比较和遗传进化分析。结果表明,JX株与A66株（DQ886445）和C80株（DQ864514）的同源性为99.5%、亲缘关系最近,JX株与GenBank上已发表的其他DHV-1核苷酸序列的相似性都在94%以上,表明JX毒株与世界其他地方不同的DHV-1分离株之间,病毒基因组具有较高的同源性。（3）根据DHV-1 JX株基因组序列,设计含有BamHI和XhoI酶切位点的VP0基因引物,含有EcoRI和XhoI酶切位点的VP1基因引物,以JX株RNA为模板,RT-PCR扩增VPO和VP1基因。将VP0和VP1基因分别克隆入原核表达载体pET-28a（+）中,构建重组表达质粒pET-28-VP0和pET-28-VPl,随后将重组质粒转化入宿主菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示重组融合蛋白VP0和VP1的分子量分别约为32kDa和30kDa。可溶性分析确认重组VP0和VP1蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。经Western-blot分析证明重组VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫学活性。综上所述,本研究对DHV-1 JX株进行基因组序列测定与分析,探讨其与不同DHV-1分离株的同源性与进化关系,表明目前世界范围内不同的DHV-1毒株之间具有较高的同源性。对DHV-1 JX株编码结构蛋白的VP0、VP1基因进行原核表达,经Western-blot分析证明重组的VP0和VP1蛋白均具有良好的免疫活性,可以作为进一步建立ELISA方法的检测抗原。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 鸭病毒性肝炎的流行与分布
• 2 DHV-1的分类地位
• 3 DHV-1的病原特性
• 4 DHV-1的纯化研究
• 5 DHV-1的诊断技术研究
• 6 DHV-1的基因组结构及其功能
• 6.1 小RNA病毒的基因组结构及其功能
• 6.2 DHV-1的基因组结构及其功能的初步分析
• 7 DHV-1的病毒蛋白及其功能
• 8 本研究的目的和意义
• 第二章 1型鸭肝炎病毒JX株基因组序列的测定与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 质粒及菌株
• 1.1.3 工具酶及主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 主要溶液及其配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 病毒的增殖
• 1.3.2 引物的设计与合成
• 1.3.3 病毒RNA的提取
• 1.3.4 RT-PCR扩增及检测
• 1.3.5 RT-PCR产物的回收与纯化
• 1.3.6 RT-PCR产物与pMD18-T载体的连接
• 1.3.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 1.3.8 连接产物的转化
• 1.3.9 质粒DNA的提取
• 1.3.10 重组质粒的鉴定
• 1.3.11 序列测定和DHV-1 JX株基因组序列的拼接
• 1.3.12 DHV-1 JX株基因组序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DHV-1 JX株基因组各片段的克隆与鉴定
• 2.1.1 DHV-1 JX株基因组序列分段RT-PCR扩增结果
• 2.1.2 目的片段的克隆及鉴定
• 2.2 DHV-1 JX株的序列测定及分析
• 2.2.1 序列测定结果及推导的氨基酸序列
• 2.2.2 不同DHV毒株的同源性分析
• 2.2.3 遗传进化分析
• 2.2.4 DHV-1 JX株基因组结构的分析
• 3 讨论
• 3.1 DHV-1 JX株与30株不同DHV毒株的同源性比较与分析
• 3.2 DHV-1 JX株基因组特征的分析
• 4 结论
• 第三章 DHV-1 JX株结构蛋白VP0、VP1基因的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 毒株和血清
• 1.1.2 质粒及菌株
• 1.1.3 工具酶及主要试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 主要溶液及其配制
• 1.2.1 抗生素类
• 1.2.2 SDS-PAGE相关溶液
• 1.2.3 Western-blot相关溶液
• 1.3 方法
• 1.3.1 VP0、VP1表达引物的设计与合成
• 1.3.2 病毒RNA的提取
• 1.3.3 RT-PCR扩增及检测
• 1.3.4 RT-PCR产物的回收与纯化
• 1.3.5 重组表达质粒的构建
• 1.3.6 重组阳性质粒的筛选与鉴定
• 1.3.7 重组表达质粒在E.coli BL21（DE3）菌中的诱导表达及检测
• 1.3.8 SDS-PAGE电泳
• 1.3.9 Western-blot分析
• 1.3.10 重组蛋白的可溶性分析
• 2 结果与分析
• 2.1 DHV-1 JX株VP0和VP1基因的扩增
• 2.2 重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.2.1 重组表达质粒的构建
• 2.2.2 重组表达质粒的鉴定
• 2.2.3 重组质粒的序列测定与分析
• 2.3 表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析
• 2.3.1 VP0蛋白的表达及SDS-PAGE分析
• 2.3.2 VP1蛋白的表达及SDS-PAGE分析
• 2.3.3 重组VP0蛋白和VP1蛋白的Western-blot分析
• 2.4 重组VP0蛋白和VP1蛋白的可溶性分析
• 3 讨论
• 3.1 重组表达质粒pET-28a-VP0和pET-28a-VP1的构建
• 3.2 重组表达质粒pET-28a-VP0和pET-28a-VP1的表达
• 3.3 重组VP0蛋白和VP1蛋白的免疫活性分析
• 4 结论
• 参考文献
• 研究生期间发表论文情况
• 致谢