论文摘要
胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）是从早期囊胚的内细胞团（innercell mass,ICM）分离出来的一种多能细胞系;它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三胚层来源的几乎所有类型的细胞。已有研究表明,ESCs在特定的诱导培养体系中,可被定向诱导分化为神经细胞,为ESCs移植治疗神经系统疾病提供了实践依据。迄今为止,体外诱导法主要有4-/4+法、五步法、基质细胞诱导法、单层粘附培养法和基因修饰法等。其中4-/4+法是最经典的诱导法,但该方法使用维甲酸（retinoic acid,RA）诱导前需形成类胚体（embryonic bodies,EB）,使分化较难控制和分析,且培养时间长、操作复杂,对细胞密度、营养、设备等培养要求较高。探索新的细胞诱导方法用以减少诱导时间、简化操作将促进ESCs体外培养分化的研究。目前对ESCs分化为神经细胞的机制仍不清。有报道称在ESCs向神经细胞分化过程中出现某些蛋白的表达增高（如PKCδ和PKCε）或者降低（如notch1）。在对大鼠嗜铬神经瘤PC12细胞分化和小鼠小脑神经元发育的研究中均发现细胞骨架蛋白4.1蛋白的表达量、剪切形式和细胞定位会随着神经细胞的分化而改变。但4.1蛋白在ESCs向神经细胞分化过程中的改变尚有待研究。目的:1.建立一种新的体外定向诱导ESCs分化为神经细胞的方法,从而缩短诱导分化时间、简化体外操作过程。2.研究在ESCs分化为神经细胞过程中4.1N和4.1B的表达情况。方法:采用郑州大学干细胞中心培育的小鼠胚胎干细胞系。组织块原代培养法制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。ESCs复苏后直接接种到经丝裂霉素C（MMC）处理的MEF上,使用含白血病抑制因子（LIF）的MEF条件化培养基（CM）进行培养和传代。待ESCs生长稳定,以105个/ml接种于培养皿中。分三组:（1）对照组:用EB培养基重悬后贴壁培养,不加入任何诱导剂,自然分化。（2）4-/4+诱导组:用EB培养基重悬,悬浮培养4d,每2-3 h摇晃1次,防止EB贴壁,第5d收集细胞,用诱导培养基(含10-6 mol/L RA)重悬,接种至明胶包被的培养皿,4 d后换为EB培养基继续培养。（3）RA序贯诱导组:用诱导培养基(含10-6 mol/L RA的EB培养基)重悬,贴壁培养48 h后,每个培养皿加入3 ml神经干细胞培养基（含20μg/L bFGF、2%B27、1%N2的无血清DMEM/F12培养基）培养2 d,此后每天加入1 ml神经细胞培养基（含2%B27、15%FBS的DMEM/F12培养基）,直到第7 d用神经细胞培养基换液,继续培养。倒置显微镜观察分化过程中细胞形态;免疫细胞化学法检测分化第10 d各组成熟神经元标志性抗原神经元特异性烯醇化酶（NSE）和星形胶质细胞标志性抗原胶质纤维酸性蛋白（GFAP）,计算NSE和GFAP的阳性细胞率;Western-blot检测分化前后4.1N和4.1B的表达量。结果:倒置显微镜下滋养层细胞MEF表现为100%融合的贴壁生长的梭形细胞。分化前ESCs呈圆形或椭圆形克隆样生长,折光性强,细胞排列紧密。对照组自然分化10 d后可见克隆团边缘几乎均为圆形高亮的上皮样细胞,外周为少量梭形细胞;4-/4+诱导组分化第5 d贴壁12 h后即可见梭形细胞爬出;分化第10 d神经样细胞突起细长并形成网络;RA序贯诱导组分化第5 d出现神经细胞样改变,细胞突起细长;神经元样细胞逐渐增多,分化第7 d呈双极性或多极性,形成网络。免疫细胞化学法检测分化第10 d对照组、4-/4+诱导组和RA序贯诱导组的NSE阳性细胞率分别是11.8%±1.8%、50.6%±2.7%和57.6%±1.4%;GFAP阳性细胞率分别是19.0%±2.9%、36.0%±2.5%和33.0%±2.0%。单因素方差分析显示对照组和两组诱导组之间有显著性差异（P＜0.01）,4-/4+诱导组和RA序贯诱导组之间无显著性差异（P＞0.05）。Western-blot检测显示:未分化ESCs中表达4.1N和4.1B蛋白,诱导分化后两者表达量都增加。结论1.RA序贯诱导法可在ESCs分化后第7d获得神经元样细胞,较4-/4+诱导法提前3d,且两者的NSE和GFAP阳性细胞率无差异,因此RA序贯诱导法可作为经典的4-/4+诱导法的替代方法。2.4.1N和4.1B蛋白的表达量随着ESCs分化为神经细胞而增加。
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