新型凝集素LSECtin相互作用蛋白研究及基因打靶载体构建

论文摘要

对于自己和非己的识别是机体免疫反应的基础,而完成这一功能的分子被称作模式识别受体（pattern recognition receptor, PRRs）。C型凝集素（C-type lectins）作为一类新型的模式识别分子,近年来逐渐显示出在病原体识别中的重要作用。同时,某些C型凝集素与配体结合后可以产生免疫抑制信号,因而许多病原微生物包括艾滋病毒、丙肝病毒等借此以逃避机体的免疫监视,但迄今对其胞内的信号转导途径仍不清楚,此方面的研究引起了人们的高度关注。LSECtin（liver and lymph node sinusoidal endothelial cells C-type lectin）是本室鉴定的一个新的C型凝集素,特异表达在肝脏和淋巴结窦内皮细胞上,具有糖基结合能力,但是其胞内的信号转导途径尚未揭示,其生理功能和分子机制了解甚少,我们对此开展了研究。 本文首先通过酵母双杂交方法筛选LSECtin的胞内区结合蛋白,并选择了四对可能存在的相互作用在酵母中进行了初步验证,证明均真实存在。继而在综合比较结合力、功能相关性、亚细胞定位的基础上,选取了其中两个蛋白IFP35（interferon-induced protein 35）和TRIP-1（TGF-β type Ⅱ receptor interacting protein-1）在哺乳动物细胞中进行进一步验证。荧光定位实验表明,当单独表达时,LSECtin为质膜上的不均匀分布和细胞质中的少量点状分布,IFP35为细胞质中的点状或弥散状分布,TRIP-1在质膜和细胞质中均有分布。而当IFP35或TRIP-1分别与LSECtin共表达时,二者均被募集到LSECtin高表达的区域,并且存在明显的共定位。同时,免疫共沉淀实验也证明二者确与LSECtin存在相互作用。此外,我们对LSECtin与TRIP-1的相互作用的生物学意义进行了探索。报告基因实验显示,LSECtin对TGF-β诱导的靶基因PAI-1表达具有抑制作用,而同家族的DC-SIGNR（DC-SIGN related gene）没有此功能,可能与其特有的生理功能相关。这些结果提示,LSECtin的胞内信号转导可能与TGF-β和干扰素途径有关。同时,为阐明LSECtin的生理功能,我们还开展了小鼠LSECtin的基因打靶工作,完成了mLSECtin基因组序列的筛选。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 前言
• 主要仪器设备和常用试剂的配制
• 第一部分 LSECtin相互作用蛋白研究
• 第一节 LSECtin与候选蛋白在酵母体系中的相互作用验证
• 第二节 LSECtin与TRIP-1、IFP35的相互作用验证
• 第三节 LSECtin抑制TGF-B诱导的PAI-1基因表达
• 第二部分 mLSECtin基因组序列筛选
• 讨论与总结
• 参考文献
• 附录1 硕士生期间完成的其他工作
• 附录2 综述
• 附录3 在读期间发表和投稿的文章
• 致谢