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幽门螺旋杆菌抗原和CTB融合基因在烟草、番茄中的遗传转化

2020-11-22阅读(768)

幽门螺旋杆菌抗原和CTB融合基因在烟草、番茄中的遗传转化

论文摘要

幽门螺旋杆菌（Helicobacterpylori,Hp）感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的发生也密切相关。目前多种药物联合治疗根除Hp存在疗效欠理想、副反应高和Hp耐药菌株不断增加等问题,疫苗有望为防治Hp感染提供一种新的途径。细胞毒素相关蛋白（Cytotoxin—associated protein A,CagA）是Hp的主要毒力因子。常与Hp空泡毒素（VacA）伴随存在,具有强免疫原性和免疫保护性,是Hp疫苗的首选抗原之一。Hp尿素酶（Urease）作为Hp的定植因子和毒力因子,表达量高,序列高度保守,其中以B亚单位（UreB）抗原性和保护作用最强,是Hp免疫防治的主要候选疫苗之一。霍乱毒素B亚单位（CTB）是霍乱毒素的非毒性部分,有很强的免疫原性,作为免疫佐剂能增强抗原蛋白的免疫效力和免疫特异性。用植物作为生物反应器来生产重要的、有经济价值的药用蛋白是“分子农业”发展的新趋势。多方面的报道证明植物可以高水平表达具有功能的重组蛋白质。烟草是基因工程中最为广泛使用的模式植物之一,生长速度快,生长周期短,农杆菌介导的遗传转化体系完善,因此广泛应用于植物疫苗的基础研究和前期研究。番茄营养丰富,果实可直接生食,是研制植物口服疫苗的理想载体。 本研究分别构建了含融合基因CTB—cagA3.1、CTB-Linker-ureB和CTB-Linker-cagA1.8的植物表达载体,采用农杆菌介导的叶盘转化法,将融合基因转入烟草和番茄中,以期获得同时表达Hp CagA蛋白或UreB蛋白和粘膜佐剂CTB的转基因植株,为研制防治人类Hp感染的有效和安全的功能性食品奠定基础。同时优化番茄的转化体系,为建立以烟草和番茄作为生物反应器来表达微生物抗原奠定了技术平台。 通过两年多的实验,获得了以下结果:（1） 构建能在烟草和番茄基因组中高效表达的含外源融合基因的植物表达载体p13-CC1N、 p23—35SCLUN、p23-35SCLCN和p121-CLUN,由CaMV 35S启动子启动,PCR分析、 酶切鉴定及DNA序列测定验证结果正确后将质粒导入农杆菌EHA105或GV3101中。（2） 构建原核表达载体pET28a-CLU,转入大肠杆菌BL-2l（DE3）中,ITPG诱导表达, 以检测融合蛋白的原核表达情况;（3） 利用农杆菌介导的遗传转化系统将融合基因导入烟草和番茄基因组中,经过抗性筛选、 分化和生根培养获得了转基因烟草和番茄植株。转化后烟草叶片抗性芽分化率可高达 100%,优化条件后番茄抗性芽分化率达40%～60%。（4）PCR验证目的基因已整合到烟草和番茄基因组中,PCR阳性率为80%～93.7%。 Western-blot检测目的蛋白在转基因植株的含量及表达情况,此实验仍在进行中。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一篇 文献综述
  • 第一章 幽门螺旋杆菌疫苗研究现状
  • 1 Hp粘膜免疫应答机制
  • 2 Hp保护性抗原
  • 2.1 细胞毒素相关蛋白（cytotoxin-associated protein A，CagA）
  • 2.2 空泡毒素（Vacuolating cytotoxin A，VacA）
  • 2.3 尿素酶及其亚单位（Urease）
  • 2.4 热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）
  • 2.5 粘附素
  • 2.6 过氧化氢酶（catalase，Kat）
  • 3 展望
  • 第二章 粘膜免疫佐剂和连接肽
  • 1 霍乱毒素（cholera toxin，CT）及其亚单位
  • 2 大肠杆菌热不稳定肠毒素（Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT）及其亚单位
  • 3 连接肽
  • 第三章 利用转基因植物生产疫苗的研究进展
  • 1 植物生产疫苗的可行性和必然性
  • 2 转基因植物疫苗的研究现状
  • 3 转基因植物疫苗存在的问题和解决办法
  • 3.1 优化植物疫苗的表达水平
  • 3.1.1 选择合适的强启动子或组织特异性启动子
  • 3.1.2 目的基因的修饰
  • 3.1.3 将蛋白定位于叶绿体
  • 3.1.4 将蛋白定位于内质网
  • 3.2 选择适当的植物表达载体
  • 3.3 受体植物的选择
  • 3.4 优化免疫途径
  • 3.5 植物疫苗的生物安全性
  • 3.6 基因沉默
  • 第二篇 研究报告
  • 第一章 含CTB和CAGA基因的植物表达载体的构建及其在烟草中的转化
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 菌株和质粒
  • 1.1.2 基因
  • 1.1.3 植物材料
  • 1.1.4 酶及主要试剂
  • 1.2 实验方法
  • 1N的构建'>1.2.1 植物表达载体p1301-35SCC1N的构建
  • 1.2.2 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化
  • 1.2.3 转化植株的鉴定
  • 2 结果与分析
  • 1N植物表达载体的构建'>2.1 p1301-35SCC1N植物表达载体的构建
  • 2.2 烟草转化植株的获得
  • 2.3 转化植株的鉴定
  • 2.3.1 报告基因的检测
  • 2.2.2 转基因植株的PCR检测
  • 3 讨论
  • 第二章 CTB-CAGA和CTB-UREB融合基因植物表达载体的构建
  • 1 材枓与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 菌株
  • 1.1.2 质粒
  • 1.1.3 目的基因
  • 1.1.4 酶及主要试剂
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 质粒DNA的碱法小量快速提取
  • 1.2.2 质粒DNA的大量提取
  • 1.2.3 DNA定量
  • 1.2.4 DNA酶切
  • 1.2.5 琼脂糖凝胶电泳
  • 1.2.6 DNA片段回收
  • 1.2.7 DNA连接
  • 2法）'>1.2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）
  • 1.2.9 DNA转化大肠杆菌
  • 1.2.10 连接产物的酶切鉴定
  • 1.2.11 质粒DNA的PCR验证
  • 1.2.12 质粒的测序
  • 1.2.13 原核表达
  • 1.2.14 农杆菌感受态细胞的制备
  • 1.2.15 质粒DNA转化农杆菌
  • 2 结果与分析
  • 2.1 p23-35SCLUN表达载体的构建
  • 2N表达载体的构建'>2.2 p23-35SCLC2N表达载体的构建
  • 2.3 重组表达载体的PCR验证
  • 2.4 序列测定
  • 2.5 pB1121-CLUN表达载体的构建
  • 2.6 原核表达载体pET28a-CLU的构建
  • 2.7 融合蛋白的诱导表达和鉴定
  • 2.8 融合蛋白的Western杂交验证
  • 2N、p121-CLUb／转入农杆菌GV3101'>2.9 质粒p23-35SCLUN、p23-35SCLC2N、p121-CLUb／转入农杆菌GV3101
  • 3 讨论
  • 3.1 Hp保护性抗原基因的选用
  • 3.2 黏膜佐剂的选用
  • 3.3 融合基因的构建
  • 3.4 质粒载体和重组方法的选用
  • 3.5 融合蛋白的Western杂交验证
  • 第三章 融合基因CTB-UREB和CTB- CAGA2在烟草中的转化
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 无菌苗的获得
  • 1.2.2 农杆菌介导的烟草叶盘法转化
  • 1.2.3 PCR检测转化植株
  • 1.2.5 Souther杂交检测转化植株
  • 1.2.6 植物可溶性蛋白的提取
  • 1.2.7 蛋白质SDS-PAGE电泳
  • 1.2.8 Western-blot杂交
  • 2 结果与分析
  • 2.1 不同浓度卡那霉素对烟草叶片再生的影响
  • 2.2 烟草转化植株的获得
  • 2.3 转基因植株的PCR鉴定
  • 2.4 转基因植株的Southern和PCR-Southern杂交鉴定
  • 2.5 烟草叶片可溶性蛋白的凝胶电泳
  • 3 讨论
  • 3.1 关于转化体的选择培养
  • 3.2 关于转基因材料的检测
  • 第四章 融合基因CTB-UREB和CTB- CAGA2在番茄中的转化
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 1.2.1 番茄无菌苗的获得和外植体的准备
  • 1.2.2 番茄高频再生体系的探索
  • 1.2.3 农杆菌介导的番茄转化体系的优化研究
  • 1.2.4 转化植株的PCR鉴定
  • 2 结果与分析
  • 2.1 番茄高频再生体系的建立
  • 2.1.1 不同培养基类型对番茄子叶再生的影响
  • 2.1.2 番茄不同外植体类型对再生的影响
  • 2.1.3 不同苗龄的番茄外植体对再生的影响
  • 2.1.4 不同浓度潮霉素对番茄子叶再生的影响
  • 2.1.5 不同浓度卡那霉素对番茄外植体再生的影响
  • 2.1.6 不同浓度头孢霉素对番茄外植体再生的影响
  • 2.1.7 不同切苗方式对番茄子叶再生的影响
  • 2.1.8 不同基因型的番茄外植体再生频率的比较
  • 2.2 番茄转化植株的获得
  • 2.3 番茄转化植株的PCR鉴定
  • 2.4 番茄高频转化体系的建立
  • 2.4.1 不同培养基类型对不同基因型的番茄外植体转化后Kan抗性芽分化的影响
  • 2.4.2 不同苗龄和外植体类型对番茄“中蔬4号”转化率的影响（培养基：MB）
  • 2.4.3 不同植物表达载体对番茄外植体转化后再生频率的影响（培养基：MZ）
  • 2.4.4 转化番茄的生根培养
  • 3 讨论
  • 参考文献
  • 缩略词表
  • 致谢

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