论文摘要
乳酸菌在引发苹果酸-乳酸发酵时由于不适应果酒环境而造成发酵迟缓,产生生物胺、氨基甲酸乙酯等有害物质；也常因发酵终止不彻底而造成生物病害。针对该问题,可向果酒中添加苹果酸-乳酸酶（malolactic enzyme, MLE）以转化苹果酸,但因MLE不耐酸而导致转化效率低；也可用细胞融合或基因工程构建降酸酿酒酵母,但用细胞融合不能成功构建降酸酿酒酵母,基因工程方法构建的降酸酿酒酵母也因存在苹果酸的运输屏障而导致转化效率低。为了更好地解决该问题,本研究欲采用酵母细胞表面展示技术构建α-凝集素表面展示载体,并以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）作为标记蛋白来验证该载体是否具有展示表达的作用。在此基础上,将MLE插入到展示载体中,进行酶的展示表达,以构建具有较强发酵性能和降酸能力的酿酒酵母工程菌,为工业葡萄酒等果酒的生产提供理论基础。主要研究结果如下：1 pADH1-AGG表面展示载体的构建本章通过PCR从pPIC9K和酵母基因组中分别扩增得到信号肽基因（267 bp）和α-凝集素锚定基因（1623 bp）,并将信号肽基因插到pADH1中,成功构建含有信号肽的载体pADHl-signal;在此基础上,插入α-凝集素锚定基因,成功构建表面展示载体pADH1-AGG。2pADH1-AGG表达和展示功能的验证以pEGFP-C1为模板,通过PCR扩增出绿色荧光蛋白基因,大小约为717 bp,并插入到展示载体pADHl-AGG中,成功构建EGFP的展示载体pADH1-GFP。通过荧光显微镜观察、蛋白酶K酶解和荧光分光光度计定位的方法研究EGFP的展示效果,具体结果如下：用荧光显微镜观察分别携带有质粒pADH1-GFP和pADHl-AGG（阴性对照）的酵母细胞,可观察到携带有pADH1-GFP的酵母细胞表面有绿色荧光,而对照酵母表面没有荧光,证实EGFP在酵母体内得到了成功的表达。用蛋白酶K分别处理携带有pADH1-GFP和pADH1-AGG（阴性对照）的酵母细胞,结果表明随着时间的延长,携带pADH1-GFP的酵母细胞表面的绿色荧光逐渐消失,直至与阴性对照酵母细胞形态一致,表明EGFP成功展示在酵母细胞表面。对酵母细胞进行破壁处理,上清和细胞壁酶解后的上清液分别用荧光分光光度计进行扫描分析,结果表明酵母细胞壁提取物的荧光值为408.936,而细胞内容物的荧光值为73.936,这说明EGFP主要定位在细胞壁上,构建的pADH1-AGG具有表达和展示的作用。3苹果酸-乳酸酶在酿酒酵母细胞表面的展示以酒类酒球菌（Oenococcus oeni）基因组为模板,通过PCR扩增苹果酸-乳酸酶基因（1600 bp）,并插入到pADH1-AGG中,成功构建展示表达载体pADH1-MLE.将该载体转化酵母细胞后,筛选得到3株阳性转化子,分别编号为Fm1、Fm4和Fm5。首先通过免疫荧光检测验证了展示在酵母细胞表面的MLE,然后用高效液相色谱检测转化子上清液中L-苹果酸及L-乳酸的含量,结果表明mle基因进行了功能性的表达,L-乳酸的生成量为488.6 mg/L,苹果酸的降低率为21.11%。
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相关论文文献
- [1].分泌表达苹果酸乳酸酶的大肠杆菌系统的构建[J]. 食品与生物技术学报 2016(05)
- [2].重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle产苹果酸乳酸酶发酵条件的优化[J]. 中国酿造 2018(06)
- [3].餐厨垃圾产乳酸酶解发酵工艺的优化[J]. 河南科学 2014(03)
- [4].植物乳杆菌R23产苹果酸乳酸酶特性研究[J]. 中国食品学报 2012(05)
标签：酿酒酵母论文; 增强型绿色荧光蛋白论文; 苹果酸乳酸酶论文; 表面展示论文; 荧光论文;